Сравнителна оценка на добива на антоцианинов пигмент и неговите атрибути от цветя на Пеперуден грах ( Clitorea ternatea L.) като проспективен хранителен оцветител, използвайки различни методи за екстракция
Received 10 August 2022, Revised 10 October 2022, Accepted 19 October 2022, Available online 20 October 2022, Version of Record 26 October 2022.
Резюме
Сред естествените цветове, синьото е може би най-трудният естествен цвят за работа, тъй като източниците са оскъдни; цветът на пигмента зависи от pH и е най-малко стабилен. Пеперуденото грахово цвете (Clitoria ternatea L.) произвежда ядливи цветя, които са богати източници на брилянтни антоцианини със син цвят, наречени “тернатини”. Настоящото проучване беше проведено с цел да се създаде ефективен, евтин и екологичен метод за екстракция на антоцианинов пигмент от цветя на Пеперуден грах с гледна точка на приложение в храните.
Сред различните използвани методи за екстракция, водният метод дава значително по-висок TMAC (7925.29±36.07 mg/l) и процент полимерен цвят (25.28±1.14%), докато по-високо възстановяване (73.17±1.76%), антиоксидантна активност , т.е.DPPH (3,49±0,59 µl/ml), FRAP (3,99±1,10 µl/ml) и ABTS ((2,42±0,01 µl/ml), общи феноли (29,78±1,79 mgGAE/100 g), общи флавоноиди (20,13±0,40 mgQE /100 g), инструментални цветови стойности, показващи брилянтно-син цвят , а именно L* (27,74±0,73), a* (46,90±0,77), b* (-63,25±0,13) и цветност (78,74±0,38) ъгъл на нюанса(306,56±0,50) са наблюдавани при метода на екстракция с помощта на микровълни (MAE). LC-MS/MS анализ на пигментния концентрат доведе до откриване на миристил сулфат и DL-ябълчена киселина, имащи фармакологично значение.
Предложеният метод за екстракция е най-безопасното, икономично, удобно и екологично решение за комерсиална екстракция на антоцианин, което може да бъде увеличено, като техника за зелена екстракция на индустриално ниво.
(Вижте всички статии за Пеперуденото грахово цвете в нашия блог)
Въведение
Цветът е едно от основните качества на храната, което е изключително важно, тъй като насърчава психологическите ефекти, допринасяйки за положително първо впечатление от продукта и задавайки тона за други сетивни характеристики (Ngamwonglumlert et al., 2017; Verma et al., 2018 ) . ; Невес и др., 2021 г).
Атрактивните цветове подобряват вкуса на храната. Може би повече от всеки друг фактор цветът определя приемливостта на хранителните продукти от потребителите и често се свързва с качеството и се използва, като надежден предсказател за безопасността и стойността на продукта. За съжаление, повечето дейности по обработка на храни, особено тези, които включват използването на топлина, водят до промяна на цвета, влошаване или дори загуба. В резултат на това се използват различни хранителни оцветители (т.е. пигменти и оцветители) за подобряване или увеличаване на цвета на храната.
Оцветителите също могат да се използват за осигуряване на консистенция на цвета, подобряване на представянето на храната или добавяне на цвят към храни, които иначе са неоцветени ( Delgado-Vargas and Paredes-Lopez, 2003 ; Mortensen, 2006 ; Ngamwonglumlert et al., 2017).
Добавки за хранителни оцветители, които се предлагат, като синтетични, естествени (извлечени от растителни, животински или минерални източници) и идентични с природата (подобни на тези, които се срещат в природата, но произведени от хора, като синтетични каротеноиди) форми се използват в хранително-вкусовата промишленост, козметика, фармацевтични продукти, храна за добитък и други приложения ( Oplatowska-Stachowiak и Elliott, 2015 ).
Естествените източници на оцветители се използват все повече, като добавки в храни, напитки и козметика в резултат на нарастващото желание на потребителите за естествени съединения, които обикновено се разглеждат като по-безопасни от техните синтетични аналози (Boo et al., 2012; De Mejia et al . , 2020 г). Въпреки факта, че синтетичните цветове са доминирали през миналия век, днес в природата все още има множество привлекателни нюанси. Световното търсене на естествени пигменти е около 10 000 тона, или около 1% от глобалното търсене на синтетични оцветители ( Singh et al., 2020 ).
Поради вниманието към храненето и здравето, потребителите осъзнават, че много естествено срещащи се пигменти от плодове, зеленчуци и ядливи цветя са не само безопасни и чисто етикетирани, но също така имат свои собствени установени предимства за здравето, които могат да придадат, когато се консумират пресни или когато се използват като компоненти в преработени храни ( De Mejia et al., 2020 ). Сред различните цветове текущото търсене на естествени сини оцветители се е увеличило ( Neves et al., 2021).). По този начин разбирането на свойствата на растителните пигменти, техния метод на екстракция, техните взаимодействия с екстракционните разтворители и тяхната стабилност при екстракция е от решаващо значение. Също така, изучаването на техните свойства в различни видове храни по време на обработката на храната е важно и представлява неизползвана възможност за използване на ползите за здравето от тези пигменти при въвеждането на нови естествено оцветени хранителни продукти.
Въз основа на естествената им поява пигментите в растенията се класифицират на хлорофили, каротеноиди, антоцианини и беталаини ( Ngamwonglumlert et al., 2017 ). Сред тях мастноразтворимите пигменти са хлорофил и каротеноиди, които съществуват в пластида на растителната протоплазма (протопласти), а водоразтворимите пигменти, които са разтворени в клетъчния сок, включват антоцианини и беталаини (Boo et al. , 2012 г. ).
Антоцианините, например, са често достъпни водоразтворими флавоноиди, намиращи се в много цветя, плодове и листа (напр . Пеперуден грах, червен лук, грозде и лилава царевица) със зависими от pH нюанси, вариращи от оранжево (пеларгонидин) до червено (цианидин). ) към синьо (делфинидин) ( Delgado-Vargas and Paredes-Lopez, 2003 ; Stintzing and Carle, 2004 ).
Сред естествените цветове синьото е може би най-трудният естествен цвят за работа, тъй като неговите ядливи естествени източници са малко. Clitoria ternatea L., известен като Пеперуден грах, от семейство Fabaceae, е едно такова растение, което произвежда ядливи цветя, които се предлагат в различни цветове, вариращи от тъмно синьо до светло синьо до бяло (Adisakwattana et al., 2020 ) .
Уникалната характеристика на антоцианините, присъстващи в цветовете на Пеперудения грах, е наличието на голямо количество полиацилирани антоцианини, известни като „тернатини“, които са полиацилирани производни на делфинидин 3,3′,5′-триглюкозид (Gamage et al., 2021 ) . Тернатините придават на цветята техния жив син цвят и са открити през 1985 г. ( Saito et al., 1985). Цветовете му също съдържат високи нива на фитохимикали, които имат антидиабетно ( Chusak et al., 2018 ), антиоксидантно ( López Prado et al., 2019 ), антимикробно ( Mahmad et al., 2018 ), противовъзпалително ( Nair et al. ., 2015 ) и антипролиферативни/антиракови свойства ( Shen et al., 2016 ).
Заедно с тези уникални антоцианини в изобилие и други вторични метаболити, растението се оказва идеалният източник на естествен син антоцианинов пигмент с биоактивни свойства, които подобряват външния вид и хранителните стойности на хранителните продукти при добавяне ( Azima et al., 2017 ; Pasukamonset ). и др., 2018 г .;Ешер и др., 2020 г. ).
В резултат на това цветовете на Пеперудения грах имат потенциала да се използват, като естествен източник на антиоксиданти и/или като добавка в хранително-вкусовата и фармацевтичната промишленост ( Jeyaraj et al., 2020 ).
Обикновено пигментите се екстрахират с помощта на метод за излугване твърдо-течно, което представлява предизвикателство за трансфер на маса, тъй като пигментите са силно прикрепени към клетъчните мембрани ( Sivakumar et al., 2011).). Установено е, че процедурата на екстракция има значително въздействие върху възстановяването на целевите пигменти. Необходими са нови стратегии за подобряване на ключовите механизми на извличане на пигменти, като разкъсване на клетъчната стена, освобождаване на пигменти и транспортиране на пигменти във външната среда. Използвайки правилната процедура на екстракция, количеството и качеството на извлечените вещества могат да бъдат подобрени. В допълнение, разтворителите, използвани при екстракцията, са от решаващо значение.
Традиционно антоцианините се извличат чрез метода на водна екстракция, тъй като пигментът е водоразтворим. Различни други разтворители, използвани за екстракция, са етанол, метанол, ацетон, хлороформ и др . По-късно бяха въведени екстракции с подкиселени разтворители за подобряване на добива. Целта на подкисляването е да денатурира мембраните на клетъчната стена, където антоцианинът е максимално разположен и много изследвания съобщават за използването на лимонена киселина, оцетна киселина, солна киселина, мравчена киселина и др., за подкисляване. Но за извличане на пигмент, разтворителите и подкиселяващите агенти с намерение за приложение в храната са много малко.
Така че е от огромно значение да се измисли подходяща среда за екстракция, както и метод, който дава пигментния концентрат на антоцианин, който не съдържа сурови химически остатъци и е икономически жизнеспособен. Освен това, сини оцветители, които в момента са най-трудни за получаване, тъй като антоцианините, отговорни за този цвят, са най-малко стабилни и лесно се разграждат след екстракция ( Tuan Putra et al., 2021 ).
Досега не е имало нито един процес на екстракция, който може да се използва за извличане на непокътнати пигменти с биоактивни свойства от различни източници. В резултат на това има нарастващо желание за нови и креативни процедури за екстракция, които използват по-малко разтворители, отнемат по-малко време, предлагат по-високи добиви на екстракция и най-важното – безопасни са за околната среда. На този фон, настоящото изследване е планирано и изпълнено, за да се оцени ефикасността на различни методи при извличането на антоцианини от цветя на Пеперуден грах от гледна точка на приложение в храната.
Материали и методи
Проучването е проведено през годините 2021–22 в катедрата по технологии след прибиране на реколтата, колеж по селско стопанство, Vellanikara, селскостопански университет в Керала, Трисур, Керала, Индия.
Приготвяне на пробата
Свежи цветя от тъмносиньо-тъмно лилав двоен тип бяха събрани рано сутринта в блока за лечебни и ароматни полета, колеж по земеделие Vellanikkara и бяха измити с течаща чешмяна вода и отцедени от водата. Венчелистчетата се отделят от чашелистчетата и се сушат в сушилня в шкаф при 40±2 °C до получаване на постоянно тегло, след което изсушените венчелистчета се смилат в търговски блендер и се пресяват през сито с размер на отворите 80. По-късно прахът от венчелистчетата се опакова в ламинирана торбичка от алуминиево фолио и се съхранява във фризер до извличане на пигмента.
Екстракция на антоцианинов пигмент
Екстракцията беше извършена с конвенционалния метод за екстракция твърдо-течна, който включва: Т1 – Водна (дестилирана вода) екстракция; Т2 – Подкиселена водна (1% лимонена киселина) екстракция; Т 3 – Екстракция с разтворител (50% етанол); Т 4 – Екстракция с подкиселен разтворител (50% етанол с 1% лимонена киселина) и Т 5-MAE с воден разтворител (дестилирана вода). Пробата се разбърква в разтворителя при температура 45 °С в продължение на 45 минути. Съотношението на растителната проба и разтворителя е 1:20 (w/v). В случая на MAE, пробата се смесва с дестилирана вода и епруветката, съдържаща суспензията, се облъчва в микровълновото устройство при 300 W за 120 s, като температурата се поддържа между 45 и 50 °C. Екстрактът се филтрува през филтърна хартия. Филтратът се събира и изпарява с помощта на ротационен вакуум изпарител (Heidolph ротационен изпарител, Германия) при 60 °C и 114 mbar ( Azima et al., 2017 ). Концентрираните филтрати се съхраняват в стъклени флакони, опаковани в ламинирана торбичка от алуминиево фолио и се съхраняват при охладени (4–7 °C) условия до анализа.
Процент на възстановяване на пигментния концентрат
Процентът на възстановяване на пигментния концентрат от цветовете на пеперудения грах се определя с помощта на следната формула ( Gonfa et al., 2020 ):
Екстракция
Общо съдържание на мономерни антоцианини (TMAC)
TMAC се оценява чрез рН диференциалния метод, както е описано от Wrolstad et al. (2005) . Аликвотни части от концентрирания пигментен екстракт за различни обработки се разреждат с буфери с рН 1,0 и 4,5, като се използва съответно калиев хлорид (0,025 М) и натриев ацетат (0,4 М), като се използва предварително определения фактор на разреждане. След това разрежданията се оставят да се уравновесят за 15 минути. Абсорбцията на всеки разтвор на пробата се записва с помощта на спектрофотометър (UV-видим 1800 спектрофотометър, Shimadzu, Киото, Япония), калибриран с дестилирана вода като празна проба при дължини на вълните от 530 и 700 nm. Разликата в абсорбцията между стойностите на pH и дължините на вълните се изчислява по формулата:
TMAC в пробата се изчислява като цианидин-3-глюкозид, като се използва следното уравнение:
TMAC
Където MW е молекулно тегло (449,2 g/mol за цианидин-3-глюкозид), DF е фактор на разреждане, ɛ е моларен коефициент (26 900 L/mol/cm за цианидин-3-глюкозид), l е дължина на пътя (1 cm ).
Свойства на цвета
Плътността на цвета (CD), полимерният цвят (PC) и процентът на полимерния цвят бяха проведени въз основа на метода, описан от Wrolstad et al. (2005) , използвайки разтвор на бисулфат. Индексът на разграждане (DI) се изчислява въз основа на метода, описан от Azima et al. (2017) и индексът на покафеняване (BI) се изчислява с помощта на уравнението BI = A 420nm /A 520nm ( Muche et al., 2018 ).
Визуалният цвят на пробите по отношение на инструменталните цветови стойности , т.е. Стойностите на L*, a*, b*, цветност ( C* ) и ъгъл на оттенък ( h° ) бяха измерени чрез измерване на отражателната способност с Minolta CM-3600D (Konica Minolta Sensing, Inc., Осака, Япония) с помощта на софтуер JAYPAK 4808 ( Система за контрол на качеството, версия 1.2), базирана на цветовото пространство CIELAB. Като еталонен източник на светлина е използвана лампа D 65 . Инструментите ще анализират L* , което е мярка за „лекота“ и две координати a* и b* . Стойностите за светлота от 100 и 0 представляват съответно абсолютно бяло и абсолютно черно. Положителни стойности на a*са в посока на червено и отрицателни стойности в посока на допълващото зелено. Положителните стойности на b* са векторът за „пожълтяване“, а отрицателните за „синьо“. Chroma е мярка за интензитет или насищане и се изчислява като (a*Cb*) 1/2 . Ъгълът на нюанса се изразява в решетка от 360°, където 0 ° синьо-червено, 90 ° жълто, 180 ° зелено и 270 ° синьо ( Wrolstad et al., 2005 ).
DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилхидразил) анализ
Активността на пробите за отстраняване на DPPH радикали се определя въз основа на метод, разработен от Chaovanalikit et al. (2012) . Процент на инхибиране = (контрола-проба)/контрола) 100 беше използван за изчисляване на процента на отстраняване на радикалите. Концентрацията на пробата, осигуряваща 50% инхибиране (Инхибиторна концентрация-ICso ) се изчислява от графиката на процента на инхибиране спрямо концентрацията. Като стандарт се използва галова киселина.
Тест за FRAP (Ferric-редуцираща антиоксидантна сила).
Намаляването на мощността се определя с помощта на FRAP анализ ( Benzie and Strain, 1996 ). FRAP реагентът се приготвя чрез добавяне на 10 части от 300 тМ ацетатен буфер, рН 3,6, една част от 10 тМ 2,4,6-трипиридил-S-триазин (TPTZ), приготвен в 40 тМ солна киселина (HCl) и една част от 20 mM железен хлорид (FeCl3 ) . Сместа беше предварително загрята до 37 o C и разредена до една трета с метанол. Този реагент (3 ml) се смесва с 0,1 ml разредени тестови проби. Сместа се разклаща и се инкубира на тъмно при 37 °С в продължение на 20 минути и абсорбцията се отчита при 593 nm. Като стандарт се използва аскорбинова киселина.
ABTS (2,2′-азино-бис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) анализ)
Анализът на ABTS радикална активност се провежда съгласно Zheleva-Dimitrova et al. (2010) с някои модификации. За да се приготви изходен разтвор на ABTS, калиев персулфат (2.45 mM) и ABTS (7 mM) се смесват заедно в равно съотношение (1:1) и се оставят на тъмно за най-малко 16 часа. Работният разтвор се приготвя чрез комбиниране на основния разтвор на ABTS с метанол преди употреба, за да се получи абсорбция от 0,706±0,01 единици. След оставяне на пробата да реагира с ABTS разтвора в продължение на седем минути, абсорбцията се измерва при 734 nm с помощта на спектрофотометър. Използва се подходящ празен разтворител. Капацитетът за отстраняване на ABTS на пигментния концентрат беше сравнен с аскорбинова киселина и процентът на инхибиране беше изчислен като активност на отстраняване на радикали ABTS (%) = [абсорбция (контрола) – абсорбция (проба)]/абсорбция (контрола) x 100, където абсорбцията ( контрола) е абсорбцията на ABTS радикала в метанол; абсорбцията (проба) е абсорбцията на разтвора на ABTS радикал, смесен с проба/стандарт. Концентрацията на пробата, осигуряваща 50% инхибиране (IC50 ) се изчислява от графиката на процента на инхибиране спрямо концентрацията.
Общо феноли
Оценката на общите феноли се извършва с реактив на Folin-Ciocalteau, както е описано от Lakshan et al. (2019) . Отчитанията на абсорбцията бяха взети при 765 nm на UV-видим спектрофотометър. Количественото определяне на общите феноли се извършва с помощта на калибровъчна крива, изготвена със стандарт на галова киселина. Резултатите се изразяват като mg еквивалент на галова киселина (GAE) на 100 g проба.
Общо съдържание на флавоноиди
Общото съдържание на флавоноиди се определя съгласно метода, предложен от Mehmood et al. (2019) . Към пробата се добавят 0,3 ml 5% натриев нитрит, 0,3 ml 10% алуминиев хлорид, 1 ml 1 М разтвор на натриев хидроксид. Обемът се довежда до 10 ml с дестилирана вода. Абсорбцията на реакционната смес се измерва при 415 nm. Кверцитинът се използва като стандарт и резултатите се изразяват като mg кверцитин (QE)/100 g проба.
Течна хроматография-мас спектрофотометрия (LC-MS/MS)
LC-MS/MS анализът се извършва на Thermo Scientific Q-Extractive Plus Biopharma система. Съединенията бяха идентифицирани с помощта на масспектрометър Orbitrap с висока разделителна способност в SAIF-IIT, Бомбай. Използваният софтуер за събиране на данни беше Thermo Scientific Xcalibur версия 4.2.28.14, а софтуерът за обработка на данни беше Compound Discover 3.2 SP1. Хроматографията се извършва на колона Thermo Scientific Hypersil Gold 3 µm (100 × 2.1 mm). Подвижната фаза беше 0.1% мравчена киселина с милилитри вода (А) и метанол (В) със скорост на потока 0.3 mL/min с тип програма за градиентно елуиране.
Статистически анализ
Експериментът беше проведен в три екземпляра и резултатите бяха изразени като средни стойности със стандартно отклонение (±SD) ( Pance and Sukhatme, 1989 ). Беше проведен еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), за да се определят значими групови разлики ( p ≤ 0,05) между средните стойности. За сравняване на средните стойности беше използван Duncan Multiple Range Test (DMRT).
Резултати и дискусия
Процент на възстановяване на антоцианиновия пигментен концентрат (%) и общо мономерно съдържание на антоцианин (TMAC) (mg/l)
В зависимост от количеството биоактивни съединения , получени в екстракта, при вакуумно концентриране варира крайното му възстановяване. Значително по-високи проценти на възстановяване се наблюдават при подкислени водни (74,03±0,84%), MAE (73,17±1,76%) и водни (72,03±1,24%) методи на екстракция. По време на процеса на екстракция се наблюдава, че количеството на самия пигментен екстракт е високо, което може да се дължи на ниското съдържание на сухо вещество във венчелистчетата. Следователно, процентът на възстановяване на пигментния концентрат при вакуумно концентриране е по-висок при всички третирания, независимо от разтворителя и приложените техники ( фиг. 2 а). Разтворимостта на различните компоненти, добивът на екстракция и антиоксидантната активност зависят от растителния материал и химията на присъстващите в него биоактивни съединения.
Фиг. 2 . Процент на възстановяване (a) и общо мономерно съдържание на антоцианин (TMAC) (b) на пигментни концентрати от цветни венчелистчета от Пеперуден грах. Различните букви в графиката показват статистически значими разлики ( P ≤ 0,05). (T 1 ) Воден (T 2 ) Подкислен воден разтвор с 1% лимонена киселина (T 3 ) Разтворител – 50% етанол (T 4 ) Подкиселен разтворител – 50% етанол с 1% лимонена киселина (T 5 ) Микровълнова екстракция с воден разтворител .
В настоящото изследване бяха използвани пет различни метода на екстракция, от които методът на водна (водна) екстракция се оказа най-ефективен, давайки по-висок TMAC от 7925,29±36,07 mg/l (фиг. 2 b ) . Антоцианините са силно разтворими във вода. Поради високата диелектрична константа (ɛ) (ɛ = 78,30) ( Chemat et al., 2019 ), водата при по-високи температури (<100 °C) има повече енергия и предлага висока скорост на дифузия, засилвайки контакта между пробата и разтворител (вода), увеличавайки максимално извличането на антоцианини в средата ( Kang et al., 2021 г.).
Няколко проучвания показват, че взаимодействието на подкислени разтворители насърчава освобождаването на пигменти, като антоцианини, от мембраната на клетъчната стена, въпреки че ефектът зависи от вида на използваната киселина. В нашето изследване добивът на антоцианин е по-малък (3772,28±116,74 mg/l) при метода с разтворител и подкислен разтворител (5771,13±54,19 mg/l). Вариациите в ефикасността на дадена комбинация разтворител/киселина може да се дължат на стъпките, включени в обработката на пигментния екстракт. Това е особено вярно, ако е необходим етап на концентриране, тъй като концентрацията на антоцианини в разтвор може да се увеличи с отстраняването на екстракционния разтворител, както и концентрацията на киселина и в резултат на това хидролизата на антоцианините може да настъпи или да бъде удължена ( Garcia-Viguera et al., 1998), засягащи окончателното възстановяване на пигмента.
Използването на органични разтворители, като метанол и етанол за извличане на антоцианинови пигменти причинява проблем с токсичността. Въпреки че етанолът се счита за като цяло безопасна екстракционна среда, изолирането на антоцианини чрез екстракция на водна основа се счита за по-екологичен начин ( Khoo et al., 2017 г.). От друга страна, методът MAE позволява по-кратко време за екстракция с по-малко разтворител и показва добра възпроизводимост. Обратно, подобряването на дифузията на съединението от матрицата към разтворителя, като същевременно потенциално увеличава добива на екстракция, също така улеснява извличането на нецелеви съединения. Антоцианините са много чувствителни към температурата. Като цяло се използват ниски до умерени мощности, заедно с удължени продължителности на екстракция в MAE, за да се предотврати прегряване, но това не спира непременно влошаването на антоцианините ( Garofulic et al., 2013 ). Това може да е причината за получаване на по-нисък (6146,86±22,98 mg/l) добив на антоцианин в сравнение с метода на водна екстракция в нашето изследване.
Антоцианините се класифицират в три типа, т.е. неацилирани, моноацилирани и полиацилирани. Както се наблюдава в няколко проучвания, цветето на Пеперудения грах е един от най-значимите източници на полиацилирани синьо оцветени антоцианини. Полиацилираните антоцианини са силно разтворими във вода и е доказано, че имат значително по-висока стабилност, особено при ниско киселинни и неутрални условия. Поради това той се счита за най-потенциалния оцветител за храни ( Marpaung et al., 2017 ; Coelho et al., 2021 ; Gamage et al., 2021 ; Thuy et al., 2021 ).
Резултатите, разкрити от Thuy et al. (2021) предполагат, че 45 ° C и 60 минути са оптималната температура на екстракция и съответно продължителност за екстракция на антоцианин. Няма да се получи високо общо съдържание на антоцианин, ако времето е твърде кратко или твърде дълго, тъй като антоцианините може да не се разтворят напълно в екстракционния разтворител, ако времето е твърде кратко. От друга страна, те се разграждат, когато се извличат за по-дълго време при високи температури, тъй като това са термо-лабилни пигменти.
Според проучване за остра токсичност, проведено от Srichaikul (2018) , когато на плъхове албиноси Wistar е дадена перорална доза от воден етанолов екстракт от цвят на пеперуден грах (2000 mg/kg телесно тегло), не е имало аномалии или признаци на смъртност и освен това , няма забележима промяна в хематологичните данни. Цветовете на Clitoria ternatea имат потенциала да се използват като функционални храни, смесени в различни хранителни продукти или дори, като медицински добавки/лекарства, комбинирани с търговски лекарства за повишаване на ефективността на лечението на пациенти ( Jeyaraj et al., 2021 ).
За да обобщим, максимизиране на разтворимостта и преноса на маса, екстракционният разтворител често се избира въз основа на полярността на целевия компонент. Препоръчваните разтворители са вода и комбинации алкохол-вода, както се съобщава в нашите резултати. Методът на водна екстракция, използващ вода като разтворител, обаче, има голям потенциал за търговска екстракция на антоцианини и продължава да бъде най-безопасната, евтина, широко достъпна и екологично безвредна алтернатива от гледна точка на обработка, която може да бъде мащабирана като зелена екстракция технология на индустриално ниво за производство на естествени хранителни оцветители с брилянтен син оттенък.
Микровълнова асистирана екстракция, както и други нововъзникващи технологии за екстракция като екстракция с ултразвук (UAE), суперкритична флуидна екстракция(SFE), течна екстракция под високо налягане (HPLE), импулсна екстракция с електрическо поле (PEFE), електрически разряд с високо напрежение (HVED), ензимно-асистирана екстракция (EAE) са безспорно ефективни по отношение на време, енергия и добив, но са трудни за разширяване поради сложността на широкомащабното внедряване, високите разходи и поддръжка, специфичността на ензима и т.н. Най-важното е, че всяка растителна проба варира по отношение на използваната растителна част, състав, чувствителност и други изисквания, специфични за конкретни проби.
Свойства на цвета
Качеството на цвета, определено количествено чрез плътност на цвета и полимерен цвят и процентен полимерен цвят и индекс на покафеняване, е показано на Фиг. 3 (a, b) и Фиг. 4(a, b), съответно. Свойствата като плътност на цвета, полимерен цвят и индекс на покафеняване се обозначават с абсорбционни единици (AU).
Плътността на цвета е мярка за силата на цвета на пробата. Методът за екстракция с разтворител доведе до по-висока стойност (562,50±63,63 AU) за плътност на цвета, което показва по-високата сила на цвета, което може да се дължи на наличието на по-висок полимерен цвят. Полимерният цвят измерва пигментираните полимери, които са устойчиви на избелване със серен диоксид, докато процентът на полимерния цвят определя процента цвят, представен от полимеризирани антоцианини, танини и кафяви съединения, които са устойчиви на избелване с натриев/калиев метабисулфит. По-ниската стойност, получена за полимерния цвят (53,70±2,10 AU) при подкислена екстракция и по-ниския процент на полимерния цвят (12,83±0. 39%) в метода MAE потвърждават, че мономерните антоцианини са преобладаващи в пигментния екстракт, а не полимеризирани феноли (танини) или кафяви съединения, полимеризирани антоцианини и други интерфериращи съединения, за разлика от мономерните антоцианини, които запазват цвета си при 4,5 pH. Поради липсата на 4 позиция в антоцианиновата структура, която е ковалентно свързана с друг фенолен компонент, мономерният антоцианин би реагирал с бисулфат, за да генерира безцветно сулфоново вещество, докато полимерните антоцианини са устойчиви на бисулфатна реакция ( Wrostland et al., 2005 ).
Увеличаването на полимерния цвят по време на топлинна обработка се дължи на реакцията между антоцианини или с други фенолни съединения . Индексът на покафеняване отразява съдържанието на кафяви съединения, а много ниските стойности (0,045 AU) показват липсата на продукти на покафеняване, генерирани от нагряване ( Patraş, 2020). От друга страна, по-високите стойности се дължат на разграждането на антоцианина, което води до образуването на халкон, който от своя страна се разгражда до кафяви продукти по време на топлинна обработка (Jiang et al., 2018 ) .
Фиг. 3 . Плътност на цвета (а) и полимерен цвят (б) на антоцианинови пигментни концентрати от цветни венчелистчета от пеперуден грах. Различните букви в графиката показват статистически значими разлики ( P ≤ 0,05). (T 1 ) Воден (T 2 ) Подкислен воден разтвор с 1% лимонена киселина (T 3 ) Разтворител – 50% етанол (T 4 ) Подкиселен разтворител – 50% етанол с 1% лимонена киселина (T 5 ) Микровълнова екстракция с воден разтворител .
Фиг. 4 . Процентен полимерен цвят (a) и индекс на покафеняване (b) на антоцианинови пигментни концентрати от цветни венчелистчета от пеперуден грах. Различните букви в графиката показват статистически значими разлики ( P ≤ 0,05). (T 1 ) Воден (T 2 ) Подкислен воден разтвор с 1% лимонена киселина (T 3 ) Разтворител – 50% етанол (T 4 ) Подкиселен разтворител – 50% етанол с 1% лимонена киселина (T 5 ) Микровълнова екстракция с воден разтворител .
Анализираните инструментални цветови компоненти по отношение на L*, a*, b*, ъгъла на оттенъка и цветните стойности на пигментните концентрати на пеперудения грах при разреждане с вода (0,01 g в 8,995 ml дестилирана вода) са дадени в таблица 1 . Стойностите на цвета при различните третирания на концентрат от цветя от пеперуден грах са значително различни. Стойностите на L*, a*, b*, цветността и нюанса варират от 18,09 до 49,24; 36.78 до 46.90; -38,02 до -63,25; 52.90 до 78.74; и съответно 306.56 до 319.44. Пробите от разреден пигментен концентрат са по-тъмни (18,09±3,95) по отношение на светлота или осветеността ( L* ) (по-нисък L*стойностите показват по-тъмен цвят) при всички третирания, с изключение на метода на подкислена водна екстракция (49,24±1,13). Червено/зеленият цветови компонент, a*, демонстрира червения цветен тон, тъй като пробите имат положителни стойности. Сините нюанси бяха обозначени с отрицателни стойности в син/жълт цветови компонент, b*. Сред различните методи на екстракция пигментният концентрат, получен чрез методите на MAE, показа ярко син цвят (-63,25±0,13), последван от водния метод (-54,79±0,88), докато светлосин цвят беше забелязан при метода на подкислена водна екстракция (- 38,02±0,41). цветността ,или интензитет на цвета, представени стойности по-близо до 100, показващи чист цвят (дълбочина на цвета). Интензитетът на цвета е по-висок (78,74±0,38) при MAE, последван от метода на водна екстракция (69,30±0,13), докато по-нисък интензитет на цвета се отбелязва при метода на подкиселената водна екстракция (52,90±0,92). Ъгълът на оттенъка показва стойностите на хроматичния цвят в диапазона от ярко синьо виолетово (306,56 ± 0,50) до синьо-виолетово (319,44 ± 1,56) съответно в MAE и метода за екстракция с подкислен разтворител. Цветът на пигментните концентрати и техният съответен визуален външен вид на цвета при разреждане с дестилирана вода са изобразени на фигура 2 .
Таблица 1 . Ефект на различни методи за екстракция върху инструменталните цветни стойности на пигментния концентрат на антоцианиновия цветен грах. Различните букви показват статистически значими разлики ( P ≤ 0,05).
Общо съдържание на феноли и флавоноиди
В нашето проучване, по-високи общи фенолни съединения (29,78±1,79 mg GAE/100 g) и флавоноиди (20,13±0,40 mg QE/100 g) са наблюдавани при микровълнова екстракция с вода, което може да се дължи на по-високата ефективност на микровълновата фурна сила при разкъсване на клетъчната мембрана и по този начин ефективно навлизане на тези съединения в пигментния екстракт ( фиг. 5 ).
В проучване, докладвано от Lakshan et al. (2019) , сравнима стойност (26,70 mg GAE/g) за общите феноли е получена от Пеперуденото грахово цвете, използвайки вода като екстракционен разтворител. Фенолните съединения са термо-лабилни по природа, така че условията на работа, особено температурата и продължителността на екстракцията, както и използвания разтворител, играят важна роля. Чрез увеличаване на скоростта на дифузия и разтворимостта на съединенията, оптималната температура (80 °C), продължителността (45 минути) и подходящият разтворител водят до ефективен масов трансфер от растителния материал в екстракта. Основните фенолни киселини , открити в C. ternatea , са протокатехуинова киселина, галова киселина и хлорогенова киселина ( Azima et al., 2017).).
По същия начин, флавоноидите също са фенолни съединения, извлечени от съдови растения и е известно, че притежават антиоксидантни свойства. Беше разкрито, че съдържанието на флавоноиди в екстракта от сладки череши е свързано с неговия антиоксидантен капацитет от González-Gómez et al. (2010) .
Според Azima et al. (2017) , мирицетинът е най-разпространеният флавоноид в цветето на C. ternatea, следван от делфинидин, епикатехин, рутин, кемпферол и кверцетин. Растителните феноли, като цяло имат висока антиоксидантна активност и са добре известни уловители на свободните радикали (Повече за свободните радикали ТУК)( Рабета и Ан Набил, 2013 г.).), тъй като те могат да неутрализират свободните радикали чрез голямото си разнообразие от функции, включително хелатиране на метали, отдаване на водород и свойства за охлаждане на синглетния кислород ( Venkatesan et al., 2019 ).
Според Altunkaya et al. (2016) , увеличаването на антиоксидантната активност на фенолните съединения с повишаване на рН може да се дължи на повишен капацитет за донорство на електрони, след молекулярно депротониране и стабилизиране в алкална среда.
(Повече за сапонините, полизахаридите и флавоноидидте прочетете в нашата статия)
Фиг. 5 . Общо фенолно и флавоноидно съдържание на антоцианинови пигментни концентрати от цветни венчелистчета от пеперуден грах. Различните букви в графиката показват статистически значими разлики ( P ≤ 0,05). (T 1 ) Воден (T 2 ) Подкислен воден разтвор с 1% лимонена киселина (T 3 ) Разтворител – 50% етанол (T 4 ) Подкиселен разтворител – 50% етанол с 1% лимонена киселина (T 5 ) Микровълнова екстракция с воден разтворител .
Антиоксидантна активност
Резултатите, отнасящи се до антиоксидантната активност на DPPH, FRAP и ABTS, са показани на Фиг. 6 . В литературата се посочва, че антоцианините, извлечени от растения, имат антиоксидантни свойства, които допринасят значително за здравето и терапевтичните ефекти. Гликозилираната B-пръстенна структура на антоцианина допринася за неговата висока антиоксидантна активност, докато ортохидроксилирането и метоксилирането значително повишават антиоксидантната активност ( Bors et al., 1990 ).
Антиоксидантите, които улавят свободните радикали, включват антоцианин халкони и хиноидни бази с двойна връзка, конюгирана с кето групата ( Wang et al., 1997).). В настоящото изследване се наблюдава по-висока антиоксидантна активност по отношение на DPPH (3,49±0,59 µl/ml), FRAP (3,99±1,10 µl/ml) и ABTS (2,42±0,01 µl/ml) в пигментния концентрат, извлечен с вода като разтворителя чрез метода на екстракция с помощта на микровълни. Някои проучвания оценяват и сравняват антиоксидантния потенциал (DPPH анализ) на екстракти, използвайки различни разтворители, разкривайки, че водният екстракт е по-мощен от 100-процентовия етанолов екстракт след 15 минути екстракция (Kamkaen и Wilkinson, 2009 ) .
Според проучването, проведено от López Prado et al. (2019) , водният екстракт от антоцианини е еднакво мощен и има по-висока антиоксидантна активност от 100 и 50% метанолови екстракти. Освен това, рандомизирано кръстосано проучване от Chusak et al. (2018) установено, че острото поглъщане на екстракт от цветя на C. ternatea или напитка повишава плазмения антиоксидантен капацитет.
Туан Путра и др. (2021) , които изследват антиоксидантната активност чрез различни анализи (DPPH и ABTS), смятат, че концентрацията на общи феноли и съдържание на флавоноиди е пропорционална на инхибиращото свойство на екстракта от антоцианинов пигмент на Пеперуден грах и по-високата антиоксидантна активност на фенолното съединение се дължи на наличието на голям брой хидроксилни групи ( Do et al., 2014 ).
По подобен начин Jeyaraj et al. (2021) не забелязват значителна разлика в антиоксидантната активност на антоцианинови екстракти от цвят на Пеперуден грах, получени чрез екстракция с вода и 50% етанол, използвайки DPPH иFRAP анализи . Това предполага, че антоцианините от Пеперуден грах могат да бъдат извлечени с дестилирана вода и използвани, като естествен син оцветител с висока антиоксидантна активност ( Gamage et al., 2021 ).
Фиг. 6 . Антиоксидантна активност (DPPH, FRAP и ABTS) на антоцианинови пигментни концентрати от цветни венчелистчета от пеперуден грах. Различните букви в графиката показват статистически значими разлики ( P ≤ 0,05). (T 1 ) Воден (T 2 ) Подкислен воден разтвор с 1% лимонена киселина (T 3 ) Разтворител – 50% етанол (T 4 ) Подкиселен разтворител – 50% етанол с 1% лимонена киселина (T 5 ) Микровълнова екстракция с воден разтворител .
Plate 1 . Следват стъпки при извличането на антоцианинов пигмент от цветни венчелистчета на пеперуден грах.
Plate 2 . Антоцианинови пигментни концентрати от цветя на пеперуден грах, повлияни от различни обработки и съответните им цветови нюанси при разреждане. (T 1 ) Воден (T 2 ) Подкислен воден разтвор с 1% лимонена киселина (T 3 ) Разтворител – 50% етанол (T 4 ) Подкиселен разтворител – 50% етанол с 1% лимонена киселина (T 5 ) Микровълнова екстракция с воден разтворител .
LC-MS/MS
Чрез използване на Orbitrap LC-MS/MS анализ с висока разделителна способност бяха открити и идентифицирани две съединения, а именно миристил сулфат и DL-ябълчена киселина. Миристил сулфатът, известен като натриев тетрадецил сулфат (натриев L-изобутил-4-етилоктил сулфат) (STS), е анионно повърхностно активно вещество, което се среща като бяло, восъчно твърдо вещество и е широко използвано като склерозиращ агент от 1946 г. във фармацевтичната индустрия ( Alakailly et al., 2015 ).
Обикновено се използва при лечение на малки разширени вени на краката, както и венозни и лимфни малформации ( Odeyinde et al., 2013 ). Механизмът на действие на STS е да предизвика максимално ендотелно увреждане с минимално образуване на тромби, което води до фиброза на лезията ( Pharmaceuticals, 2012).), което води до свиване. Съдовата луминална облитерация може или не може да бъде постоянна ( Frullini, 2000 ). Натриевият тетрадецил сулфат е показал ефикасност при лечението на няколко кожни проблеми, като арикозни вени, телеангиектазии, хемангиома, пиогенен гранулом, черешов ангиом, сарком на Капоши, лимфангиома циркумскриптум, киста на дигиталната лигавица, ганглийна киста, гломангиома, ангиокератом на Фордайс, псевдокиста на ушната мида и веруката ( Jenkinson et al., 2017). Може да се отдели от пигментния концентрат и да се използва за клинични цели. Ябълчената киселина се намира в други плодове като ябълки, грозде, дини, череши и в зеленчуци като моркови и броколи. Тази киселина се използва главно в хранителни приложения, включително бонбони и напитки. Придава тръпчив вкус, понижава pH, има антимикробни ефекти и придава специални свойства за смесване и фиксиране на вкуса. Използва се и като ароматизатор и консервант в храни, макар и не толкова често използван като лимонената киселина ( Goldberg and Rokem, 2009 ).
Заключение
Сред естествените цветове синьото е може би най-трудният естествен цвят за работа, тъй като източниците са оскъдни; цветът на пигмента зависи от pH и е най-малко стабилен. Пеперудният грах произвежда годни за консумация цветя, които са богат източник на яркосини антоцианини, наречени „тернатини“. Цветето също така съдържа високи нива на фитохимикали, които имат антидиабетни, антиоксидантни, антимикробни, противовъзпалителни, антипролиферативни и противоракови свойства. В настоящото изследване беше получен пигментен концентрат с ярко син оттенък с високи антиоксидантни свойства, като се използва вода като разтворител със и без MAE.
Въпреки че разполагаме с други хранителни разтворители, които може да имат някои предимства пред водата, използването на вода като разтворител за екстракция на антоцианин е икономично, екологични и търговски жизнеспособни, тъй като антоцианините са водоразтворими, особено когато се фокусираме върху получаването на син оттенък, който е по-стабилен при неутрално pH.
Настоящите открития може да представляват интерес за производителите на храни, тъй като естествените сини пигменти могат да се използват вместо синтетични сини оцветители в преработени храни, тъй като те не само са безопасни и чисто етикетирани, но също така имат свои собствени установени предимства за здравето.
В бъдещите експерименти фокусът трябва да бъде върху това как да се увеличи максимално стабилността на пигмента при различни условия на съхранение, запазване на антиоксидантните свойства, стабилност на пигмента при прилагане към различни преработени продукти