Приложение на Пеперудения грах в козметичната индустрия (Статия №2)

Резюме

Въведение

      Идеята за устойчиви продукти в момента присъства във всеки аспект от човешкия живот. Храни, фармацевтични продукти, дрехи и други ежедневни продукти се произвеждат с нарастваща скорост в съответствие с принципите на устойчивото развитие. Силната нужда от производство на устойчиви продукти се наблюдава и в козметичната индустрия. 

      Поради нарастващата информираност на потребителите и популярността на натуралната козметика, производителите са принудени да актуализират своите продуктови портфолиа. В днешно време, ако искат да останат конкурентоспособни на пазара, те трябва да въведат в офертите си не само натурална козметика с високи концентрации на естествено извлечени суровини, но и устойчиви продукти, които, както очакват потребителите, са комбинация от високо ниво на безопасност за човешкото здраве и за околната среда и високо качество, функционалност [1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ].

      Производството на козметика, съдържащо суровини, получени директно от природата във формулата или високи концентрации на естествено извлечени съставки, не гарантира устойчив продукт. За разлика от типичната натурална козметика, разработването на устойчиви козметични продукти изисква използването не само на естествено добити суровини, но преди всичко на ефективни съставки, които нямат отрицателно въздействие върху околната среда и човешкото здраве [ 9 , 10 , 11 ] . 

     Пример могат да бъдат етеричните масла, които въпреки че са 100% естествени, се характеризират с неблагоприятно въздействие върху кожата чрез високия си алергичен потенциал. Някои етерични масла също могат да бъдат вредни за околната среда, особено за водната среда [ 3, 4 , 5 , 6 ]. Подобен проблем се отнася до повърхностно активните вещества, използвани във формулата на почистващата козметика. Въпреки естествения си произход, много от тях се характеризират с висок потенциал за дразнене на кожата и имат отрицателен ефект върху околната среда [ 1 , 3 , 7 ]. 

     В този случай създаването на устойчива почистваща козметика изисква използването на допълнителни съставки за намаляване на отрицателните взаимодействия на повърхностноактивните вещества с кожата или нежни повърхностно активни вещества с нисък дразнещ потенциал [ 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 ,19 ]. За съжаление и двата метода водят до значително по-висока цена на крайния продукт.

     Боите, които позволяват да се получат подходящите естетически характеристики на продукта, са един от най-големите проблеми за козметичната индустрия при създаването на устойчиви продукти [ 2 , 3 , 7 , 8 ]. В допълнение към аромата, цветът на продуктите все още е един от основните критерии, използвани от потребителите при покупка на козметика. Повечето от багрилата, които обикновено се използват в козметичните формули, са синтетични и се получават чрез химични реакции. В случай на натурална козметика, производителите обикновено използват хранителни бои с по-безопасен токсикологичен профил или минерален пигмент, като железни оксиди, активен въглен, хромни оксиди или ултрамарин [ 7 , 8 , 20]. 

     Някои от тях обаче се характеризират с негативно въздействие върху здравето чрез дразнещо действие върху кожата и очната лигавица. В допълнение, някои оцветители могат да окажат неблагоприятно въздействие върху естествената среда, както като краен продукт, така и чрез процеса на тяхното производство (странични продукти от синтеза, висока консумация на вода в производствения процес, генериране на отпадъци след производството) [ 20 ] . Ето защо има голяма нужда от провеждане на изследвания върху нови оцветители както за козметиката, така и за хранително-вкусовата промишленост, които да нямат неблагоприятни ефекти върху здравето и околната среда и да отговарят на принципите на устойчивото развитие.

     В това проучване беше направен опит за разработване на екологични, безопасни и функционални багрила, извлечени от растителни материали. Такива суровини могат да бъдат нови, биоразградими, многофункционални съставки на козметиката, които могат да действат и като биоактивни съставки с антиоксидантен потенциал и потенциал против стареене. 

     В това изследване бяха анализирани цветни екстракти, получени от пет растения, богати на естествени багрила: Gomphrena globasa L. (GGE), Clitoria ternatea L. (KTE), Carthamus tinctorius L. (CTE), Punica granatum L. (PGE), Papaver rhoeasL. (PRE).

     Екстрактите бяха оценени за тяхната цитотоксичност към клетките на кожата (кератиноцити и фибробласти), антиоксидантен потенциал и способността да инхибират ензимите, отговорни за разграждането на колаген и еластин. Потенциалът на екстрактите за намаляване на трансепидермалната епидермална загуба на вода (TEWL) и ефектът върху нивото на хидратация на кожата след прилагането им върху кожата също беше анализиран. Освен това бяха извършени анализи на приложението, които включваха разработването на формули на козметични продукти (крем за лице, съдържащ получените екстракти като боядисващи и активни съставки). Извършен е цветен анализ на получените екстракти и козметични продукти.

Резултати и дискусия

Определяне на антиоксидантни свойства

     Както бе споменато по-горе, фенолните съединения и флавоноидите показват силни антиоксидантни свойства, както е показано от множество изследвания. Доказана е и корелация между съдържанието на биоактивни съединения и антиоксидантния потенциал на екстрактите [ 26 , 27 ]. Подробният анализ на състава на изследваните екстракти доведе до откриване на фенолни киселини, хининова, галова, кафеена и хлорогенова киселини. 

      Флавоноидите са представени от производни на кверцетин, рутин и кемпферол [ 26]. Ето защо в следващата стъпка от изследването беше извършен анализ на антиоксидантната активност на изследваните екстракти, като изследването беше извършено с различни методи. Първо беше използван методът DPPH. Тестовете с този метод са проведени при концентрация 100 μg/mL. В резултат на това бяха реализирани седем точки на измерване за анализираната концентрация на тествания екстракт.

Анализ на Фигура 1 води до следните изводи. Първо, във всички изследвани случаи имаше монотонно увеличение на отстраняването на DPPH радикали в наблюдаваното време. Характерна констатация е, че за всеки изследван екстракт, след 30 минути от измервания експеримент, изчистването е по-високо с около 20% в сравнение с първоначално регистрираната стойност. Друго интересно наблюдение е, че във всеки момент от експеримента изследваните екстракти са подредени по един и същи начин по отношение на измереното извличане на DPPH радикали, започвайки от най-ниските стойности за KTE, след това последователно CTE, GGE, PRE, завършвайки с най-високата стойности за PGE (Фигура 1). Изследването, проведено от Madhu [ 27 ], показва увеличение на DPPH с увеличаване на концентрацията на екстракта, дори достигайки 70% за KTE в по-висока концентрация (600 μg/mL).

     Свободните радикали реактивни кислородни видове, ROS (Повече за реактивни кислородни видове, ROS в нашата статия), генерирани в клетките на кожата, са един от основните фактори, предизвикващи процеса на стареене на кожата. Растителните екстракти, като богат източник на антиоксиданти са в състояние да намалят вътреклетъчния оксидативен стрес и да подобрят способността на кожата да забавя процеса на стареене. Намаляването на оксидативния стрес (Повече за оксидативния стрес в нашата статия) влияе върху ускоряването на регенерацията на кожата, което може да бъде важно, например, в процесите на заздравяване на рани. 

     В нашето изследване влиянието на екстрактите беше анализирано върху вътреклетъчното производство на ROS в кератиноцитите и фибробластните клетки. Това изследване е проведено с помощта на флуорогенно H2 _DCFDA багрило. След пасивна дифузия на _Н2DCFDA в HaCaT и BJ клетки, той се деацетилира от вътреклетъчни естерази до нефлуоресцентно съединение. В присъствието на ROS, той се окислява до силно флуоресцентен 2′,7′-дихлорофлуоресцеин (DCF).

     Беше показано (Фигура 3A и B), че всеки от анализираните екстракти има способността да намалява концентрацията на ROS в BJ клетките. Най-силен потенциал за минимизиране на оксидативния стрес във фибробластите е показан за PRE, PGE, CTE и KTE екстракти при концентрация от 250–500 μg/mL. Флуоресценцията за тези екстракти е около 40–50% по-ниска, отколкото за контролата (клетки, които не са третирани с екстракти). 

     Вътреклетъчните антиоксидантни свойства за GGE екстракти са по-ниски, отколкото за други екстракти и стойността на флуоресценцията е по-ниска с около 20–25% по отношение на контролата. Най-ефективните екстракти за понижаване на нивото на ROS в кератиноцитните клетки са PRE екстрактът (в диапазона на концентрация 50–250 μg/mL) и PGE, KTE и CTE екстрактите при най-високата анализирана концентрация от 500 μg/mL.

     Силният антиоксидантен потенциал (два пъти по-нисък от този на контролата) е получен за CTE екстракта при концентрация от 500 μg/mL. GGE екстрактът достига по-висока стойност на флуоресценция от контролата, което може да се дължи на най-ниската концентрация на активни съставки. Способността за намаляване на вътреклетъчния оксидативен стрес в HaCaT клетки чрез PGE и KTE екстракти в концентрация 50–250 μg/mL е подобна на тази на контролата.

     В това изследване анализираните екстракти са получени от цветове на растения, които са богати на естествени багрила. Най-популярните растителни багрила са от групата на флавоноидите, от които най-голямата група са антоцианините. C. tinctorius L. съдържа като основно багрило картамин (червено-оранжево багрило) [ 28 , 29 , 30 ], G. globosa L. съдържа бетацианини, които са розово-виолетови на цвят (гомфренин, изогомфренин II и изогомфренин III) [ 31 , 32 , 33 ]. Основното багрило на цветята на C. terantea L. са антоцианините, наречени тернатини [ 34 , 35 , 36 ]. Цветът на P. rhoeas L. се дължи на наличието на червени антоцианини, чийто цианидол е основният компонент [ 37 , 38 ]. 

     В допълнение към багрилата, растителните екстракти съдържат и други активни съставки, включително полифеноли, протеини и въглехидрати. Полифенолите и флавоноидите са отговорни за антиоксидантната активност, включително способността за намаляване на оксидативния стрес, генериран от ROS в клетките.

     Многобройни изследвания са показали силен антиоксидантен потенциал на основните оцветяващи съединения, съдържащи се в цветята на растенията [ 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 ,37 , 38 , 39 , 40 , 41 ]. Slezak и др. показват, че водният екстракт от кората на нар при ниски концентрации се характеризира със способността да намалява вътреклетъчния (V79 клетки) оксидативен стрес след 24 часа инкубация. С кратко време на инкубация (1 час), екстрактът от нар действа като прооксидант [ 40 ]. Hong и др. са показали, че добавянето на екстракт от Carthamus tinctorius като багрилен компонент на храната има антиоксидантни свойства и способността да намалява вътреклетъчното ниво на ROS в клетките HT-29 [41 ] . Анализът на литературните данни показва, че другите екстракти не са тествани преди това за способността им да намаляват вътреклетъчния оксидативен стрес.

Оценка на инхибирането на матричната металопептидаза

     Процесът на стареене на кожата може да бъде разделен на две категории: вътрешно и външно стареене. Вътрешното (естествено) стареене се причинява от промени в еластичността на кожата през годините. Външното стареене е резултат от излагане на кожата на слънчева радиация (фотостареене). 

     Прекомерното производство на реактивни кислородни видове в резултат на вътрешни или външни фактори увеличава синтеза и активира тези протеази, което води до разграждане на извънклетъчния матрикс, включително колагенови и еластинови влакна [42] . 

     Осемдесет процента от сухото тегло на кожата е колаген, който е отговорен за якостта на опън на кожата. Колагеновите и еластиновите влакна се произвеждат от фибробластите и се влияят основно от фотостареенето, което води до видими промени в кожата като бръчки, пигментация и промени в дебелината  [43]. 

     Растенията съдържат голямо разнообразие от съединения, които могат да допринесат за забавяне на разграждането на съдържащите се в кожата колаген и еластин и да стимулират техния синтез. Тези свойства влияят върху ускоряването на процесите на регенерация на кожата, заздравяването на рани и белези и забавянето на процесите на стареене на кожата [ 44 , 45 ].Способността за инхибиране на еластазата и колагеназата е определена за пет вида растителни екстракти и резултатите са показани в Фигура 4 и Фигура 5.

     Проведеният анализ показа, че тестваните екстракти имат различен капацитет за инхибиране на еластазата, което води до инхибиране на хидролизата на субстрата. 

     За да се сравни относителната ефикасност на тестваните инхибитори, бяха проведени и тестове с контролния инхибитор SPCK.

     Беше наблюдавано, че инхибиращата способност на еластазата зависи от концентрацията на екстракта. PGE има най-големи инхибиторни свойства, като е способен да инхибира активността на еластазата с почти 50% при концентрация от 250 µg/mL и почти 40% за концентрация от 100 µg/mL. Освен това при GCE се наблюдава силно инхибиране на активността на този ензим (около 40% при концентрация от 250 µg/mL). Подобни стойности са получени за инхибиране на колагеназа. Беше наблюдавано, че способността за инхибиране на колагеназата също зависи от концентрацията на екстракта. При концентрация от 250 µg/mL най-голяма антиколагеназна активност има PGE, CTE и GGE екстракт на ниво от около 40% и почти 30% за концентрация от 100 µg/mL за PGE. Останалите растения показват по-нисък инхибиращ капацитет за тази матрична металопротеиназа (20–30% за по-високата тествана концентрация). Тези резултати предполагат, че растителните екстракти имат значителни антиеластазни и антиколагеназни свойства.

     Фактът, че активните съставки на растителните екстракти могат да допринесат за способността за инхибиране на металопептидазите, е доказан от много автори. Хроматографски анализи на получените екстракти показват наличието на различни полифенолни съединения като рутин, кверцетин, производни на кемпферол и фенолни киселини като кафеена, хининова, галова и хлорогенова (3- и 5-кафеоилхинова киселина). Литературни проучвания показват, че тези съединения могат да предотвратят разграждането на колаген и еластин чрез инхибиране на активността на колагеназата и еластазата. Съответно количество кверцетин е забелязано в PRE екстракта. Доколкото знаем, кверцетинът е често срещано активно съединение против стареене [ 46]. Кверцетинът като инхибитор на липидната пероксидация може да предпази кожата от дехидратация. Инхибирането на кверцетин на активността на матриксната металопротеиназа може също да покаже роля в защитата на кожния колаген от разрушаване по време на възпалителен отговор към външни фактори на стареене [ 47 ]. Екстрактът от PGE също показва високо съдържание на галова киселина, която може да подобри еластичността на кожата в дермата чрез изчистване на свободните радикали и инхибиране на активността на MMP-2. Sastravaha и др. Доказано е, че някои фенолни съединения, като танини, присъстващи в PGE екстракта, могат да осигурят синергичен ефект при стабилизиране на колагена, като показват афинитет към протеините и по този начин създават връзки с колагенови влакна [48] .]. 

     Водните екстракти от цвете KTE (250 μg/mL) намаляват увреждането на mtDNA в UV-индуцирани човешки обезсмъртени кератиноцити (HaCaT) [ 49 ]. Zemour и др. [ 50 ] демонстрира антиколагеназна и антиеластазна активност на CTE масло като потенциална суровина за използване в козметични продукти. В допълнение, Dakhil et al. [ 51 ] съобщават, че свойствата на CTE маслото могат да го направят основен компонент на препаратите за лечение на различни кожни проблеми. Наличието на различни полифенолни съединения може да действа като обещаващи кандидати за интервенции против стареене чрез потискане на хранителните сигнали, директно неутрализиране на стресори или активиране на пътища, реагиращи на стреса, като по този начин намалява увреждането на биомолекулите [ 52]. 

     Освен това, полифенолите могат да удължат продължителността на живота и да подобрят здравето при различни животински модели чрез намаляване на оксидативния стрес и нискостепенно хронично възпаление, индуциране на автофагия, както и регулиране на няколко важни молекули, участващи в повишаването на енергийната хомеостаза и митохондриалната функция  [53] . 

     Поради значителната антиколагеназна и антиеластазна активност на полифенолите, присъстващи в получените растителни екстракти, те могат да бъдат потенциални кандидати за противодействие на ефектите от стареенето в козметичната и фармацевтичната индустрия.

Оценка на цитотоксичността

     Оценката на цитотоксичността на екстрактите върху клетките на кожата е изключително важен елемент в контекста на оценката на екстрактите като потенциални съставки на козметични препарати. По този начин следващият етап от изследването беше да се изследват цитотоксичните свойства на тестваните PRE, PGE, KTE, CTE и GGE екстракти. 

     За целта са използвани тестовете Alamar Blue и Neutral Red. Изследването е проведено върху две кожни клетъчни линии – фибробласти и кератиноцити. Резазурин, използван в теста Alamar Blue, се използва като индикатор за окисление-редукция, който претърпява колориметрична промяна поради намаляването на клетъчния метаболизъм, което позволява оценка на клетъчната жизнеспособност in vitro. Само в случая на GGE екстракта се наблюдава намаляване на жизнеспособността на тези клетки след прилагане на по-високи концентрации на екстракта (Фигура 6А). 

     Останалите екстракти повлияват положително жизнеспособността на тези клетки. Подобни резултати са получени в случая на кератиноцитите; но цитотоксичният ефект се наблюдава и при по-високи концентрации на екстракта от KTE. Останалите екстракти повишават жизнеспособността на HaCaT клетките (Фигура 6Б). 

     Измерването на количеството освободено неутрално червено багрило позволява определяне на общия брой жизнеспособни клетки, третирани с анализираните екстракти. В случай на фибробласти, само GGE екстрактът не повлиява значително жизнеспособността на клетките, докато останалите екстракти повишават жизнеспособността с до 51% в случая на PRE екстракта в концентрация от 250 µg/mL. Увеличение с почти 40% също се наблюдава в случай на използване на PGE и CTE екстракт при концентрации съответно 250 µg/mL и 500 µg/mL (Фигура 7А). 

     В случая на кератиноцитите всички анализирани екстракти показват положителен ефект върху жизнеспособността на тези клетки. Въпреки това, KTE и GGE екстрактите при по-високи концентрации леко намаляват количеството на включеното багрило в лизозомите, което показва частично намаляване на активността на тези клетки. Проведеният анализ показа, че тестваните екстракти показват дозозависим ефект върху метаболитната активност и пролиферацията на кожните клетки (Фигура 7Б). 

      Липсата на цитотоксичност на тези екстракти показва, че те могат да се считат за ценни съставки в козметични и дерматологични препарати, предназначени за грижа и лечение на кожни заболявания. Екстрактите PRE, PGE и CTE се оказаха особено обещаващи суровини.

     Тъй като растителните екстракти са ценен източник на съединения с ценни биологични свойства, те често се възприемат като ценни суровини с положителен ефект върху клетките, включително клетките на кожата. Заслужава обаче да се отбележи, че някои от съединенията, присъстващи в растенията, проявяват цитотоксични ефекти и следователно анализът на ефекта на тези екстракти върху жизнеспособността на клетките е изключително важен за оценка на възможността за тяхното използване в различни видове препарати [ 54 , 55]. 

     По-специално, има само няколко научни доклада относно цитотоксичността на растенията, които тествахме, особено в контекста на кожата. Цитотоксичността на съединенията, съдържащи се в PRE, е била изследвана преди това от други автори, но повечето от изследванията са фокусирани върху анализа на ефекта върху раковите клетки. Ефектът на алкалоидите, съдържащи се в PRE, е изследван от Ali Hijazi et al. използвайки различни клетъчни линии, както нормални, така и ракови. Тези автори показват, че стойностите на IC50 за отделните алкалоиди върху нормалните клетки са по-високи, отколкото върху раковите клетъчни линии, което показва селективността на цитотоксичната активност на тези съединения спрямо раковите клетки. Тези автори също така посочват, че въпреки цитотоксичния ефект на избрани алкалоиди от PRE върху кератиноцитите, самият екстракт показва много по-слаби цитотоксични ефекти [56 ]. Това вероятно се дължи на наличието на други биологично активни съединения в PRE екстрактите, като, наред с другото, феноли и флавоноиди, които влияят положително върху жизнеспособността на кератиноцитите и по този начин водят до факта, че целият екстракт повишава метаболитната активност и клетъчната пролиферация, както е показано в нашите изследователски анализи. 

     Положителният ефект на PGE екстрактите вече е показан от други автори, които посочват, че както вида на екстракта, така и частта от растението влияят върху свойствата на получения екстракт. Aslam и колеги посочиха, че екстрактът от кора на нар основно подпомага регенерацията на дермата, докато маслото от семена на нар основно подпомага регенерацията на епидермиса [ 57] .]. Pacheco-Palencia и др. демонстрира защитния ефект на PGE срещу увреждане на кожните фибробласти, причинено от UVA и UVB клетки. Тези автори посочват, че ефектът от този екстракт вероятно е свързан с намаленото активиране на провъзпалителния транскрипционен фактор NF-kappaB, проапоптозната каспаза-3 и повишената G0/G1 фаза, което води до възстановяване на увреждане на ДНК [ 58 ]. Насири и др. въпреки това посочва, че екстрактите от PGE цветя могат да стимулират пролиферацията на кожни клетки и да поддържат процесите на заздравяване на рани in vivo [ 59]. 

     Положителният ефект на KTE върху пролиферацията на кератиноцитите и фибробластите също беше посочен преди това от Zagórska-Dziok et al., Които не наблюдават никакъв цитотоксичен ефект и увреждане на клетъчните мембрани, третирани с екстракти от цветя на това растение [60 ] . Освен това, Zakaira et al. показаха положителен ефект на KTE цветя върху кератиноцитите и посочиха защитен ефект срещу индуцирана от водороден пероксид цитотоксичност. Този ефект вероятно е резултат от антиоксидантната активност на полиацилираните антоцианини и флавонол гликозиди, съдържащи се в екстракта от цветя KTE [ 49].

     Екстрактите от CTE също са били обект на научни изследвания, които показват техните ценни свойства. Junlatat et al., в своите изследвания, посочват, че екстрактът от CTE floret стимулира пролиферацията както на клетките на дермалните папили, така и на кератиноцитите (HaCaT) и може значително да стимулира съдовия ендотелен растежен фактор и кератиноцитния растежен фактор [61 ] . Освен това, проучванията на Liu et al. показват, че по-високите концентрации на CTE могат да инхибират пролиферацията и синтеза на колаген от фибробластите в хипертрофичен белег in vivo, което може да допринесе за инхибирането на този тип образуване на белег [ 62] .]. 

     Екстрактът от цветя GGE досега не е тестван за цитотоксичност към клетките на кожата, така че тази работа за първи път показва възможността за безопасно използване на този растителен екстракт в препарати, предназначени за контакт с кожата. Положителният ефект на анализираните екстракти със сигурност е свързан с наличието на множество биологично активни съединения, чието взаимодействие допринася за защитния ефект на тези растения върху клетките на различни слоеве на кожата.

Анализ на приложението

     Показано е, че анализираните растителни екстракти се характеризират с високи SPF фактори. При концентрация от 50 mg/mL, екстрактите KTE и CTE достигат най-високата SPF стойност (SPF около 31) поради силната способност да абсорбират UV радиация. Малко по-ниски стойности (SPF около 28) бяха демонстрирани за PRE и PGE екстрактите, а най-ниската SPF стойност (SPF около 20) беше наблюдавана за GGE екстракта. Korać и Khambholia посочиха, че активните съставки на растенията с най-голямо въздействие върху SPF са кверцетин, цианидин, апигенин, кафеена, хининова и ферулинова киселина, както и силимарин, ресвератрол, юглон, аскорбинова киселина, токофероли и каротеноиди[65]. 

     Ranjithkumar и др. показаха, че маслото от семена на нар има силна способност да абсорбира ултравиолетовата радиация на нивото на синтетичните слънцезащитни продукти (SPF около 20), а екстрактите от плодове и кори от нар, приготвени в метанол, могат да действат като UV бустери, повишавайки SPF стойността на синтетичните и минералните продукти. UV филтри [ 66 ]. Westfall и др. показаха, че червилата, пигментирани с естествено извлечени антоцианини, постигат SPF по-висок от 15 [ 64 ].

     Биоактивните съставки на растителните екстракти също влияят положително на състоянието на кожата, като повишават нейната влажност. Вещества като флавоноиди и полифеноли, както и протеини и аминокиселини, поради наличието на хидроксилни групи в молекулите, могат да образуват водородни връзки с водата и да задържат влагата в кожата. Той оказва влияние не само върху нивото на влажност на кожата, но също така може да намали количеството вода, което се изпарява от горния слой на епидермиса (трансепидермална загуба на вода, TEWL) [69 ] . За получените екстракти се определя ефектът върху влажността на кожата и TEWL след прилагането им върху кожата (Фигура 9А, Б).

     Прилагането на анализираните екстракти (концентрация от 10 mg/mL) върху кожата води до значително повишаване на нивото на влажност на кожата. Общо 60 минути след нанасяне на екстракта, екстрактите PRE, PGE, CTE и GGE показаха най-силни овлажняващи свойства. По отношение на контролното поле (без прилагане на екстракт) се отбелязва повишение на анализирания параметър с около 20–30%.  KTE екстрактът показа малко по-слаби овлажняващи свойства. 

     Общо 360 минути след нанасяне на анализираните екстракти върху кожата не е отбелязано значително намаляване на влажността на кожата, но наблюдаваните стойности са значително различни от контролата. Нивото на влажност на кожата, наблюдавано за PRE, PGE, CTE и GGE екстракти, е около 25–35% по-високо, отколкото за контролата. 

     В случай на екстракт от KTE, се наблюдава увеличение на влажността на кожата с около 10% (спрямо контролата). Подобни резултати са получени при анализа на TEWL. Най-силните свойства, свързани с намаляването на TEWL, са наблюдавани за PGE и PRE екстракти. Стойността на TEWL 60 мин. и 360 мин. след прилагането на тези екстракти е по-ниска в сравнение с контролното поле съответно с около 35% и 25%. За екстракта от KTE намалението на TEWL е около 15% и 5% по отношение на контролата, съответно след 60 и 360 минути от момента на прилагане на екстракта. 

     Получените резултати показват, че анализираните екстракти осигуряват дълготрайно овлажняване на кожата и са ефективни средства за защита срещу прекомерна загуба на вода. Стойността на TEWL 60 min и 360 min след прилагането на тези екстракти е по-ниска в сравнение с контролното поле съответно с около 35% и 25%. За екстракта от KTE намалението на TEWL е около 15% и 5% по отношение на контролата, съответно след 60 и 360 минути от момента на прилагане на екстракта. 

     Получените резултати показват, че анализираните екстракти осигуряват дълготрайно овлажняване на кожата и са ефективни средства за защита срещу прекомерна загуба на вода. Стойността на TEWL 60 min и 360 min след прилагането на тези екстракти е по-ниска в сравнение с контролното поле съответно с около 35% и 25%. За екстракта от KTE намалението на TEWL е около 15% и 5% по отношение на контролата, съответно след 60 и 360 минути от момента на прилагане на екстракта. Получените резултати показват, че анализираните екстракти осигуряват дълготрайно овлажняване на кожата и са ефективни средства за защита срещу прекомерна загуба на вода.

Определяне на цветовите параметри на екстрактите

    Активните съединения, съдържащи се в растителните екстракти, могат да се използват като багрила.

    Въз основа на експеримента е установено, че сред изследваните екстракти следните проби имат най-голям потенциал за използване като багрило: P. rhoeas L. (PRE), C. ternatea L. (KTE) и C. tinctorius L. (CTE). За PRE и CTE бяха получени относително високи стойности на цветност (C*), съответно 3,7 и 8,2. Въз основа на стойностите на параметъра h ^o беше установено, че ясно различимите цветове на горните екстракти са съответно червени и жълти. 

     Интересен екстракт, от гледна точка на възможността за боядисване на козметика, е и този, означен като KTE (синьо-виолетов цвят). Въпреки че C * стойността за KTE е относително ниска (2,2), цветът на екстракта е ясно видим с просто око. Екстрактите от P. granatum L. (PGE) и G. globasa L. (GGE) са с жълт цвят, като получените стойности на цветност са на ниво 2,5. За този цвят тези стойности не се забелязват значително с просто око. Използването на последното от растенията, споменати като потенциални багрила, изисква използването на много по-високи концентрации.

Определяне на цветовите параметри на козметика на базата на екстракти

    Растителните екстракти, богати на биоактивни вещества, които освен това имат способността да придават цвят, могат да бъдат ценна суровина за козметичната индустрия [ 70 ]. В това изследване е направен опит да се демонстрира емпиричната възможност за използване на разработените екстракти в козметиката. Беше изготвена серия от кремове за грижа за кожата на лицето, съдържащи 1% от анализираните екстракти (Фигура 10). 

     Установено е, че добавянето на 1% водно-етанолов екстракт от P. rhoeas L. (PRE), C. ternatea L. (KTE) и C. tinctorius L. (CTE) значително променя външния вид на крема. Отделните препарати имат ясно видим цвят, съответно: червен, синьо-виолетов и жълт. Потвърждение за възможността за използване на гореспоменатите екстракти, като потенциални багрила са относително високите стойности на ΔE _{крем+екстракт/основен крем} , свързани с промяната на цвета на крема с добавянето на екстракта в сравнение с основния крем. 

     Литературни данни [ 71] показват, че в случай на стойност на DE > 5, получателят възприема отделните цветове като напълно различни. За кремове с PRE, KTE и CTE екстракти получените стойности са съответно: 11,88; 31.71 и 22.72. При кремове с екстракти: P. granatum L. (PGE) и G. globasa L. (GGE) не се наблюдава значимо влияние на екстракта върху цвета на препарата. Стойностите на DE са в диапазона 1,59–1,63. Това означава, че разликата в цвета е забележима само за опитен наблюдател [ 70 , 71 ].

Материали и методи

Определяне на биоактивни съединения и антиоксидантни свойства

Определяне на биоактивни съединения чрез HPLC–UV-ESI–MS

     Получените екстракти бяха анализирани за определяне на техните основни биоактивни съединения с помощта на високоефективна течна хроматография, HPLC (DionexΜgtiMate 3000 RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), свързана с масспектрометър, MS (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON , Канада), оборудван с източник на йонизация с електроспрей (ESI) и масов анализатор с троен квадруполен йонен капан, работещ в режим на сканиране за наблюдение на множество реакции (MRM). Хроматографското разделяне се постига с градиентна система с обратна фаза. 100 × 4,6 mm хроматографска колона Kinetex 3,5 µm XB-C18 100 Å с изо-бутилови странични вериги и с TMS затваряща стационарна фаза, използвана с предпазна колона с подобен състав, беше закупена от Phenomenex и поддържана при 30 °C. Бинарна система от разтворители, съдържаща 0,1% ( v / v) воден разтвор на мравчена киселина като разтворител А и метанол като разтворител В се използва в градиентен режим за 19.1 минути от времето на изпълнение. Приложените условия на елуиране са както следва: 0.0–15.0 min 25–100% B, 15.0–17.0 min 100% B, 17.0–17.1 min 100–25% B, 17.1–19.1 min 25% B. Скоростта на потока на подвижния фаза е 0,6 mL/min и инжекционен обем 10 μL. Елуентът се наблюдава чрез електроспрей йонен масспектрометър (ESI-MS) в режим на отрицателни йони и се сканира от m / z20 до 1000 Da. За количествен анализ тройният квадруполен MS детектор работеше в режим на сканиране за наблюдение на множество реакции (MRM). Оптималните условия на масовия анализатор и изборът на продуктови йони за отделните съединения бяха определени експериментално. За тази цел стандартни разтвори на изследваните съединения (1 ng/mL) в състава на подвижната фаза бяха въведени с помощта на инфузионна помпа, работеща при постоянно подаване на проба. След като се уверите, че е избран правилният прекурсорен йон, потенциалът за декластериране (DP), входният потенциал (EP), изходният потенциал на клетката за сблъсък (CXP), енергията на сблъсък (CE) бяха оптимизирани за всеки MRM преход ( Фигура S1). Бяха наблюдавани два MRM прехода, един за количествено определяне и един за потвърждение. Параметрите на MS бяха зададени както следва: капилярна температура от 600 °C, завесен газ при 35 psi, газ за пулверизиране при 60 psi и изсушаващ газ при 50 psi. За определяне на биоактивни съединения беше приложен източник на напрежение в режим на отрицателна йонизация -4500 V. Азотът беше използван като завеса и газ за сблъсък. Анализът на данните беше обработен със софтуер Analyst 1.5.1. Идентифицирането на избраните съединения беше проведено чрез молекулна маса и фрагмент от анионни входове на всяко отделно съединение и потвърдено чрез MS2 фрагментация. Идентичностите на 9 съединения бяха определени заедно с тяхната химична формула, депротонирани молекулни йони и характерните фрагментни йони за всеки отделен пик. Общо 6 съединения бяха количествено определени на базата на калибрационната крива, генерирана с помощта на пикови площи на най-интензивните MRM преходи на аналитичните стандарти. Линейността на реакцията на детектора за количествено определени съединения беше демонстрирана чрез инжектиране на стандарти за калибриране при осем нива на концентрация, вариращи от 0,1 μg/mL до 20 μg/mL. Кривите на калибриране бяха линейни с коефициентите на корелация (R) по-големи от 0,99. В случаите, когато пробите не попадат в линейния диапазон на MS детектора, пробите се разреждат. Аналитични стандарти на хининова киселина, галова киселина, кафеена киселина, кафеоилхинови киселини (CQA, два изомера: 3- и 5-CQA) и кверцетин бяха закупени от Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, САЩ). Всички използвани стандарти са с аналитичен клас (≥99% чистота). Стандартните изходни разтвори се приготвят чрез точно претегляне и разтваряне на 20 mg от всеки стандарт в 10 mL LC-MS клас метанол, за да се получи концентрация от 2 mg/mL. След това се правят серийни разреждания от 2,0 μg/mL, 1,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL, 0,02 μg/mL и 0,01 μg/mL с помощта на LC-MS клас метанолов разтвор. LC-MS/MS анализът се извършва в три екземпляра. Получените данни бяха представени като средни стойности ± стандартни отклонения.

 

DPPH анализ за отстраняване на радикали

     Способността на получените екстракти да улавят свободните радикали се определя с помощта на 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH) радикал. Методът, описан от Brand-Williams et al. [ 72] беше използван. Първоначално 33 µL водни разтвори на екстракти при концентрации от 100 µg/mL се смесват със 167 µL метанолов разтвор на DPPH (4 mM) и се прехвърлят в 96-ямкова плака. Анализираните проби се смесват старателно чрез разклащане. В следващия етап се измерва абсорбцията на пробите при 517 nm. Измерванията се правят на всеки 5 минути в продължение на 30 минути на UV-VIS филтър Max λ = 5 спектрофотометър (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Бяха извършени три независими повторения за всеки екстракт. Като контрола се използва вода с разтвор на DPPH. Антиоксидантният капацитет се изразява като процент от инхибирането на DPPH, като се използва уравнението:

където: Abs контрола е абсорбцията на контролната проба (съдържаща DPPH и вода), Abs проба е абсорбцията на тестовата проба (съдържаща DPPH и тестова проба).

 

ABTS+ тест за почистване

     Почистването на свободния радикал ABTS + (2,20-азино-бис(3-етилбензотиазолин-6-sμgfonic киселина) диамониева сол) беше оценено съгласно процедурата, описана от Gaweł-Beben et al. [ 73 ]. След това 19,5 mg ABTS и 3,3 mg калиев персулфат се смесват със 7 ml фосфатен буфер (рН = 7,4) и се разтварят за 16 часа на тъмно. Разтворът се разрежда до абсорбция на ниво от около 1.0 (измерване при λ = 734 nm). След това, 20 µL от KTE, PGE, PRE, CTE и GGE екстракти се смесват с 980 µL разреден ABTS•+ разтвор и след това се инкубират за 10 минути на тъмно. Намаляването на ABTS•+ абсорбцията се измерва при λ = 734 nm с помощта на UV/VIS спектрофотометър Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Като празна проба се използва дестилирана вода. Почистването ABTS + се изчислява от уравнението:

където: As – абсорбция на пробата; Ac—абсорбция на контролната проба. Измерванията се извършват в три екземпляра за всяка проба от екстракт.

 

Откриване на вътреклетъчни нива на реактивни кислородни видове (ROS)

     За да се определи способността на анализираните екстракти (PRE, CTE, GGE, KTE и PGE) да генерират вътреклетъчното производство на реактивни кислородни видове в HaCaT и BJ клетки, беше използвано флуорогенно багрило H2DCFDA. След пасивна дифузия на това съединение в клетките, то се деацетилира от вътреклетъчни естерази до нефлуоресцентно съединение. В присъствието на реактивни кислородни видове, той се окислява и се трансформира в силно флуоресцентен DCF. За да се определи вътреклетъчното ниво на ROS в HaCaTs и BJ, клетките се посяват в 96-ямкови плаки при плътност от 1 × 104 клетки на ямка. След това клетките се култивират в инкубатор за 24 часа. Средата DMEM беше отстранена и заменена с 10 цМ H2DCFDA (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA), разтворен в свободна от серум DMEM среда. HaCaT и BJ клетките се инкубират в H2DCFDA за 45 минути и след това се инкубират с екстрактите в диапазона на концентрация от 50–500 µg/mL. Клетки, третирани с 1 mM водороден пероксид (H2O2), се използват като положителни контроли. Контролните проби бяха клетки, нетретирани с тестваните екстракти. DCF флуоресценцията се измерва на всеки след 90 минути с помощта на четец на микроплаки FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) при максимално възбуждане от 485 nm и емисионни спектри от 530 nm [74 ].

Оценка на инхибирането на матрични металопептидази

Определяне на анти-еластазна активност

     За да се определи възможността за инхибиране на матриксната металопротеиназа, неутрофилна еластаза (NE), беше приложен флуорометричен комплект (Abcam, ab118971). Съгласно инструкциите на производителя и с процедурата, описана по-рано от Nizioł-Łukaszewska et al. [ 75], анализите бяха извършени в стандартна 96-ямкова плака с ясно плоско дъно. Извършен е анализ за всички растителни екстракти в концентрации от 100 и 250 µg/mL. Първоначално бяха приготвени NE ензимни разтвори, NE субстрат и контролен инхибитор (SPCK) съгласно инструкциите. След това разреден разтвор на NE се добавя към всички ямки. Тестовите проби, инхибиторната контрола и ензимната контрола (буфер за анализ) бяха добавени към следващите ямки. Всички проби бяха приготвени в два екземпляра. След като всички реагенти бяха добавени, пробите бяха смесени. След това плаката се инкубира при 37 ° С в продължение на 5 минути. Междувременно се приготвя реакционна смес чрез смесване на буфера за анализ и NE субстрата. Сместа се добавя към всяка ямка и се разбърква старателно. Флуоресценцията се измерва незабавно при дължина на вълната на възбуждане λ = 400 nm и емисия λ = 505 nm с помощта на четец на микроплаки (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Използва се кинетичен режим (30 минути при 37 °C). Способността за инхибиране на NE активността на анализираните проби се изчислява от уравнението:

 

Крайният резултат беше средната аритметична стойност от три независими измервания.

 

Определяне на антиколагеназната активност

     За да се оцени способността на получените екстракти от PRE, PGE, KTE, CTE и GGE да инхибират колагеназната активност, беше приложен флуорометричен комплект (Abcam, ab211108). Съгласно инструкциите на производителя и с процедурата, описана по-рано от Nizioł-Łukaszewska et al. [ 75], анализите бяха извършени в стандартна 96-ямкова плака с ясно плоско дъно. Анализът използва аналогични концентрации на тестваните проби, както в случая на описания по-горе тест, оценявайки възможността за инхибиране на еластаза. Първоначално колагеназата (COL) се разтваря в буфер за анализ на колагеназа (CAB). Тестовите проби бяха приготвени чрез добавяне на анализираните проби към COL и CAB. Контролните проби на инхибитора се приготвят чрез смесване на колагеназния инхибитор (1,10-фенантролин (80 mM)) с колагеназа и CAB буфер. Ензимните контролни ямки се приготвят чрез смесване на разреден COL с CAB. CAB буферът беше използван като фонов контрол. Приготвените проби се инкубират в продължение на 15 минути при стайна температура. Освен това се приготвя реакционна смес чрез смесване на колагеназния субстрат с CAB. Така приготвената реакционна смес се добавя към всички анализирани проби и се разбърква старателно. В следващия етап флуоресценцията беше измерена при дължина на вълната на възбуждане λ = 490 nm и емисия λ = 520 nm с помощта на четец на микроплаки (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Измерването се извършва в кинетичен режим за 60 минути при 37 °C. Всички проби бяха приготвени в два екземпляра съгласно инструкциите на производителя. Способността за инхибиране на COL активността на получените екстракти се изчислява по уравнението: Всички проби бяха приготвени в два екземпляра съгласно инструкциите на производителя. Способността за инхибиране на COL активността на получените екстракти се изчислява по уравнението: Всички проби бяха приготвени в два екземпляра съгласно инструкциите на производителя. Способността за инхибиране на COL активността на получените екстракти се изчислява по уравнението:

 

Определяне на слънцезащитен фактор (ин витро)

     Слънцезащитният фактор (SPF) на екстракта от зелено кафе и ферментиралото зелено кафе се определя съгласно метода, описан от уравнението на Мансур. SPF се определя чрез измерване на абсорбцията на воден разтвор (50 µg/mL) на изсушения екстракт или фермента в диапазона на дължината на вълната от 290 до 320 nm на интервали от 5 nm. SPF е изчислен от уравнението на Мансур [ 77 ]:

където: EE (λ) — спектър на еритемния ефект, I (λ) — спектър на слънчева интензивност, Abs (λ) — абсорбция на слънцезащитен продукт, CF — коефициент на корекция (= 10), E (λ) × I (λ) — стойности използвани са определени от Sayre [ 78 ].

Изводи

     Резултатите от изследването, представени в тази работа, показват, че изследваните екстракти могат да се възприемат като ценен източник на безопасни и функционални багрила, които могат да бъдат широко използвани в козметичната индустрия. 

     Безспорното предимство на тези суровини е широкият спектър на биологична активност, доказан в тази работа, благодарение на който те могат не само да бъдат съставка, която придава характерен цвят на козметиката, но и да действат като биоактивни съставки. Освен това резултатите от извършените анализи не показват цитотоксичност и висок антиоксидантен потенциал, което показва липса на негативен ефект върху клетките на различни слоеве на кожата.

     Екстрактите от P. rhoeas L. (PRE), C. ternatea L. (KTE) и C. tinctorius L. (CTE) могат да се използват, като ефективни оцветители в козметични продукти. Кремовете, които ги съдържат, се отличават с интензивен и устойчив цвят във времето.

     Поради факта, че много багрила, използвани досега в козметичните препарати се характеризират с отрицателно въздействие върху кожата и околната среда, резултатите, получени в това проучване, могат да се превърнат в импулс за производителите да обмислят възможността за използване на тези екстракти, като устойчиви оцветители съставки с изключителни биологични свойства.