Стевията (Stevia Rebaudiana Bertoni), източник на високоефективен естествен подсладител—Биохимична и генетична характеристика
Резюме
Стевия е естествен подсладител, който все повече се използва в билкови лекарства в хранително-вкусовата и козметичната промишленост. Молекулярните методи могат да се комбинират с морфологични техники за идентифициране на генотипове на стевия като изходен материал за производство на по-надеждни биопродукти. Това проучване оценява нивото на генетичното и биохимично разнообразие в различни генотипове на Стевия, използвайки HPLC (високоефективна течна хроматография) анализ и произволно амплифицирани полиморфни ДНК (RAPD) маркери. Генотипите на Стевия, събрани от различни места по света, показват ясни вариации на биохимично и генетично ниво в полските климатични условия.
Влиянието на генотипите върху съдържанието на стевиол гликозиди, антиоксиданти, феноли, флавоноиди и танини е анализирано с помощта на фитохимични анализи. Генотипове от Мароко, Полша, Египет, и Нигерия могат да бъдат определени, като проби с по-високо качество в сравнение с други анализирани генотипове по отношение на количеството стевиол гликозиди. Като се има предвид съотношението ребаудиозид А/стевиозид, като критерий за селекция, генотипове от Австралия, Китай, Индия и Пакистан трябва да се считат за ценни по отношение на пригодността за получаване на нови сортове. Настоящите резултати от анализа на RAPD маркера показват различен модел на ивици и значителен полиморфизъм сред всичките десет генотипа на стевия. Генотипове от Мароко, Египет, Полша, Нигерия, Китай и Индия, като генетично различни, могат да бъдат избрани за по-нататъшни програми за размножаване на стевия. Китай, Индия и Пакистан трябва да се считат за ценни по отношение на годността за получаване на нови сортове.
Въведение
Налице е нарастваща тенденция хората да консумират храни с ниско съдържание на захар и калории . Stevia rebaudiana Bertoni ( семейство Asteraceae ) е естествена подсладителна билка [ 1 ]. Листата на Стевия произвеждат вторични метаболити (дитерпенови гликозиди), които са около 300 пъти по-сладки от захарозата [ 2]. Японците са извършили над 40 000 клинични проучвания, които показват, че стевиол гликозидите са безопасни, когато се използват като подсладител.
Възможните медицински приложения често са били изследвани с помощта на екстракти от стевия като интравенозни инфузии при мишки, за да се разкрие ефектът й върху глюкозния метаболизъм, диурезата, теглото на органите, ендокринната функция или антиандрогенната активност.
Екстрактите от Стевия също са показали, че вероятно са полезни, като антиоксиданти и редуктори на кръвното налягане и хипертонията [ 3 ].
Всички горепосочени свойства на стевиол гликозидите позволяват широкото им използване в билкови лекарства (тоници за пациенти с диабет), хранително-вкусовата промишленост (десерти, сосове, кетчупи, напитки, хляб, плодови сокове, формули за спортисти) и козметика (води за уста и пасти за зъби, кремове) [ 4].
Нарастващото търсене на естествени подсладители накара фермерите в много страни да отглеждат стевия в голям мащаб, а също така са проведени проучвания за култивиране в различни части на света, от Азия до Северна и Южна Америка [ 5]. Растенията Стевия, отглеждани в Европа, често са недефинирани сортове, размножени главно чрез конвенционални вегетативни методи. Те се характеризират с високо генетично разнообразие, което не гарантира производството на стевиол гликозиди и други фитохимикали на постоянно високо ниво.
Хранителните добавки и медицинските препарати на базата на такива растения не осигуряват единен висок стандарт. Следователно производството на фитопродукти от този вид растения не е възможно в търговски мащаб. Следователно изчерпателното описание на растенията Стевия, като изходен материал за производство на биопродукти, както на биохимично, така и на молекулярно ниво е много важно.
Молекулярните методи могат да се комбинират с морфологични техники за по-надеждно идентифициране на генотипите на Стевия. Молекулярните маркери са ценни инструменти за характеризиране и оценка на генетичното разнообразие в рамките на и между сортовете и популациите. Доказано е, че различни маркери могат да разкрият различни класове вариации. Това е свързано с фракцията на генома, изследвана от всеки тип маркер, тяхното разпределение на генома и целевия диапазон на ДНК, анализиран от всеки специфичен анализ [6 ]. Молекулярната характеристика помага да се определи поведението при размножаване на видовете, индивидуалния репродуктивен успех и наличието на генен поток, трансфер на алели в рамките на и между популациите на един и същи или сродни видове и последствията [7 ] .
Случайно амплифицираната полиморфна ДНК (RAPD) е удобен метод за откриване на генетично разнообразие. RAPD има няколко предимства, като простота на използване, ниска цена и използване на малки количества растителен материал. Доказано е, че RAPD маркерите са полезни като генетични маркери за кръстосано опрашвани култури Stevia , при които е наблюдавано високо генетично разнообразие [ 3 , 6 , 8]. Голямо предимство на RAPD маркерите е, че не е необходимо да се знае последователността на ДНК шаблон, докато късата дължина на праймерите означава, че маркерите са разпределени в целия геном както в кодиращи, така и в некодиращи области [9 , 10 ] . RAPD маркерите са силно полиморфни и позволяват разграничаването дори на много сходни генотипове [ 11 ]. Тази техника може да се комбинира с други, като RFLP (полиморфизъм на дължината на рестрикционни фрагменти), SSR (прости повторения на последователности) или ISSR (между прости повторения на последователности), за да се получат по-точни и специфични маркери [10, 11 ] .]. От RAPD маркери, след секвениране на техните продукти, могат да се получат по-специфични SCAR (последователно характеризиран амплифициран регион) маркери [ 12 ].
Признаването на генетично и биохимично разнообразие е основата за започване на програми за развъждане и е от съществено значение за селекцията на генотипове на растенията. В това проучване ние оценихме нивото на генетично и биохимично разнообразие в различни генотипове стевия от различни региони на света, използвайки HPLC анализ и RAPD маркери, за да установим базова линия за подпомагане на бъдещи програми за размножаване на този вид.
Резултати и дискусия
Химичен анализ
Сумата на стевиол гликозидите в изследваната група генотипове варира от 5,22–12,97%. Литературните данни показват различно съдържание на стевиол гликозиди в зависимост от условията на растеж и методите на култивиране, чието количество може да варира от 2% до 20% прясно листно тегло [ 13 , 14 ]. Според Mishra et al. [ 15 ] стевиозидът е основният подсладител в листата на растенията Stevia rebaudiana (от 5–15% сухо вещество); следните са ребаудиозид А (2–6% сухо вещество), ребаудиозид С (1–2% сухо вещество) и дулкозид А (0,4–0,7% сухо вещество). Съдържанието на стевиозид в изследваната група генотипове варира от 2,68% в генотипа от Индия до 8,09% в генотипа от Пакистан (маса 1). Стойностите за стевиозид, получени в това проучване, са по-високи от тези, докладвани от Parris et al. [ 16 ] и Vouillamoz et al. [ 17 ]. Райна и др. [ 18 ] анализира листата на стевия от Индия и показва наличието на стевиозид в диапазона от 4,25% до 7,32%, и ребаудиозид А в диапазона от 2,01% до 4,13%, което е потвърдено в настоящото изследване. По-високи стойности са получени от Pereira et al. [ 19], който съобщава, че съдържанието на стевиозид в листата на стевия варира от 6,98% до 12,16%. Сравнението на съдържанието на ребаудиозид А в изследваната група генотипове показва най-ниското съдържание (1,17%) на това съединение в генотипа от Малайзия и най-високото (4,48%) в генотипа от Австралия. Установеното съдържание на ребаудиозид А е по-ниско от докладваното от Parris et al. [ 16 ], Pereira et al., [ 19 ] и Vouillamoz et al. [ 17 ]. На свой ред Gardana et al. [ 20 ], Goyal et al. [ 4 ], Atteh et al. [ 21 ], Jaworska et al. [ 22 ] и Khiraoui et al. [ 14 ] получава по-ниско съдържание на ребаудиозид А в суровината.
Според Makapugay et al. [ 23 ] и Geuns [ 24 ], ребаудиозид B, D, E и F представляват микрокомпоненти. В нашето изследване ние показахме, че ребаудиозид C и D всъщност са компоненти с най-ниска концентрация в анализираната суровина. Ние доказахме, че генотипите с произход от Малайзия и Парагвай съдържат най-ниски количества ребаудиозид C и D, а тези, получени от Китай и Австралия, най-високи.
Този резултат потвърди, че както при други вторични метаболити, гликозидният профил на стевия е обект на значителни вариации в зависимост от географския район, степента на зрялост на растението, условията на околната среда, датата на прибиране на реколтата и метода на обработка.
Тъй като промените в състава на растителната матрица могат да повлияят на неговия сладък вкус, както и да променят неговите терапевтични и токсични свойства, е необходимо да се контролира качеството на суровината, за да се гарантира ефективността и безопасността на употребата на този вид в храната. и медицина. В същото време, ние наблюдавахме в нашите проучвания по-високо съдържание на ребаудиозид D в генотипове, в които открихме най-ниското съдържание на стевиозид. Интересно е, че в анализираните генотипове не идентифицирахме стевиол и ребаудиозид B, E и F. Два стевиола, присъстващи в растителната тъкан, стевиозид и ребаудиозид A,8 ].
Трябва да се има предвид, че общото съдържание на стевиозид и ребаудиозид А показва качеството на суровината и резултатите, показват разлики в съдържанието на тези съединения в зависимост от произхода на семената. Така генотипове от Мароко, Полша, Египет и Нигерия имат висока концентрация на съединения с висок индекс на сладост и ниска токсичност. Следователно, генотипове от Мароко, Полша, Египет и Нигерия могат да бъдат определени, като проби с по-високо качество в сравнение с други генотипове, анализирани за количеството стевиол гликозиди.
Програмите за размножаване на стевия трябва да имат за цел подобряване на общото съдържание на гликозиди и съотношението ребаудиозид А/стевиозид с по-висок добив на листа [ 25 , 26 ]. Съотношението естествен ребаудиозид А/стевиозид в листата на стевия обикновено е около 0,5 или по-малко [ 26 ]. Приемайки съотношението ребаудиозид А/стевиозид над 1 като критерий за подбор, подобно на Kaplan и Turgut [ 2], генотипове от Австралия (генотип 9), Китай (генотип 1), Индия (генотип 3) и Пакистан (генотип 8) трябва да се считат за ценни по отношение на годността за получаване на нови сортове.
Общото съдържание на фенол, изразено в mg·g -1 сухо тегло (DW) на тестваните проби в еквивалент на галова киселина (GAE). Показани са значими разлики ( p < 0.05) в общото фенолно съдържание между изследваните генотипове. Генотипове от Парагвай, Малайзия и Индия имат най-високи общи полифеноли (ТР). В допълнение, съдържанието на фенолни киселини и танини в тези генотипове е най-високо, но е показано, че количеството на флавоноиди (mg катехинов еквивалент/g стевия) в листата на тези генотипове е най-ниско. Показателно е, че по отношение на общите флавоноиди най-високите стойности (12,99 до 12,38 mg·g −1DW) са получени за генотипове, в които са определени най-ниските съдържания на TP, TPA и общи танини (TT). В същото време екстрактите от листата на тези генотипове показват най-голяма толерантност към DPPH• свободните радикали. Получените резултати по отношение на общото ниво на феноли, флавоноиди и антиоксидантна активност са в съответствие с тези, докладвани от Periche et al. [ 27 ] върху листа от стевия, изсушени при конвенционални условия. Въпреки това не са открити проучвания за сравнение на генотипове по отношение на съдържанието на фенолна киселина.
Молекулярен анализ
Необходимо е да се изследват и идентифицират различни генотипове за различни приложения, включително производство на вторичен метаболит или подобряване на растенията чрез размножаване. Няколко проучвания показват, че RAPD анализът може успешно да се приложи за идентифициране на вариации в генома на стевия. Thiyagarajan и Venkatachalam [ 8 ] съобщават за геномни ДНК полиморфизми и фитохимични вариации на Stevia rebaudiana (Bertoni), използвайки RAPD-PCR на три екземпляра на S. rebaudiana (L1 до L3). Гупта и др. [ 25 ], анализира вариацията на морфологични и молекулярни (RAPD) нива и извършва анализ на хеморазнообразието с помощта на LC-MS сред седем екотипа, събрани от различни щати на Индия. Анализ на генетичната вариабилност в Stevia rebaudiana събрани от различни места по света е проведено в това проучване с помощта на RAPD маркери. Stevia rebaudiana Bert. генотиповете са анализирани с помощта на 40 RAPD праймера (Sigma-Aldrich), от които 10 произвеждат голям брой полиморфни и повтарящи се фрагменти.
Продуктите за амплификация на генотип с използването на тези 10 праймера дават общо 79 ленти, подлежащи на оценка. Размерът на продуктите на амплификация варира от 400–2200 bp. Избраните праймери произвеждат 57 полиморфни фрагмента. Анализираните ДНК фрагменти показват вариации в наличието на полиморфизми. Продуктът, амплифициран от праймер 9, има най-висок полиморфизъм (87.5%), докато фрагментът, амплифициран от праймер 10, показва най-нисък полиморфизъм (60%). Подобна пропорция на полиморфизъм (67,24–92,40%) е наблюдавана от Chester et al. [ 28 ], който анализира 11 генотипа, използвайки 10 RAPD праймера. Средната стойност на полиморфизма за това проучване (72%) е подобна на резултатите, получени от Thiyagarajan и Venkatachalam [ 8 ]—81%—и Gupta et al. [ 25]—67%. Десет RAPD праймера усилват различен брой мономорфни и специфични продукти. Най-голям брой мономорфни ивици се произвеждат от праймери 2 и 3. Праймери 2, 5, 7, 9 не амплифицират никакви специфични продукти. Пример за RAPD пръстови отпечатъци на десет генотипа на стевия, използвайки праймер 2, е представен вФигура 1. Стойността на Rp на десет RAPD праймера варира от 1,2 до 6,4 (Таблица 3). В настоящото проучване праймерите RAPD с високи стойности на разделителна способност успяха ясно да разделят повечето от анализираните генотипове. Вариациите в генетичната структура в рамките на даден вид обикновено се свързват с географски обхват, начин на възпроизвеждане, система на чифтосване, разпространение на семена и плодовитост [ 25 ]. Генетичното разнообразие, открито в настоящото изследване, може да бъде причинено от някои или всички тези фактори. Това е в съответствие с изследването на Thiyagarajan и Venkatachalam [ 8 ] и Gupta et al. [ 25 ], които съобщават за наличието на генетична вариация в екземплярите на S. rebaudiana от различни региони на Индия.
Материали и методи
Растителен материал
Суровината за изследване е получена от агротехническия опит на Катедрата по зеленчукови и лечебни растения. Семената на стевия са получени от 10 институции и компании, участващи в отглеждането на нови сортове стевия. Засяването на семена е извършено в отопляема оранжерия през второто десетилетие на януари 2018 г. в саксии, пълни с градински субстрат. Растенията са засадени на постоянно място през първото десетилетие на май. Проби от здрави листа от 10 произволно избрани растения бяха събрани след 120 дни вегетация на полето, т.е. на 28 август 2018 г., отгледани в експерименталната ферма на катедрата по зеленчуци и лечебни растения на Университета за природни науки в Люблин ( 51°14′53″N, 2°34′13″E). Веднага след прибиране на реколтата, листата се замразяват в течен азот и се съхраняват при -20 ° C до анализ. Пробите от суров материал се смилат преди анализ. Пробата от всяка проба се съхранява в отдела за зеленчукови и лечебни растения на Университета за природни науки в Люблин, Полша, под номера ST1/2018/340.
Фитохимични анализи
Подготовка на пробата и екстракция
10 g изсушени на въздух и натрошени листа се екстрахират в апарат на Soxhlet в 150 mL метанол в продължение на 8 часа. След това екстрактът се изпарява до сухо и се разрежда с 10 mL ацетонитрил. Разредените проби се центрофугират (5 минути, 21 000 × g , Universal 32, Hettich, Германия), филтрират се през 0,2 μm мембранен филтър за спринцовка (Costar X, Corning Inc., Солт Лейк Сити, Юта, САЩ) и се прехвърлят в чаша флакон.
Фракциониране на стевиол гликозидни съединения с помощта на HPLC
Стевиол гликозидите бяха анализирани с помощта на LaChrom-Merck HPLC система, оборудвана с DAD (Diode Aral Detection) диоден детектор (L-7450), бинарна помпа (L-7100), дегазатор (L-7612), термостат (L-7360), Rheodyne инжектор и LiChrospher 100 стоманена колона RP C18 (250 mm × 4 mm), напълнена със стационарна фаза (dp = 5 μM). UV откриването се провежда при 210 nm при 28 °C и скорост на потока от 0.750 mL/min. Разделянето се постига в градиентен режим вода: ацетонитрил (A: B), 0–4 min 100–70% B, след това 5–10 min 70–35% B, след което се връща към B за 5 min. За да се увеличи разделянето, към двете подвижни фази се добавя 0,005% мравчена киселина. Проследени са стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид В, ребаудиозид С, ребаудиозид D, стевиол. Резултатите бяха сравнени с тези, получени за чисти стандарти.
Количествено определяне на фенолни съединения
Общите полифеноли (TP) са определени в сухи екстракти с процедурата на Folin-Ciocalteau [ 30 ]. За да се подготви калибрационната крива, аликвотни части от 0,1 mL от 0,037, 0,072, 0,108, 0,144 и 0,108 mg/mL разтвори на етанолова галова киселина се смесват със 7,9 mL вода, 0,5 реагент Folin -Ciocalteau и 1,5 mL 20 % натриев карбонат. Абсорбцията се отчита след 2 часа при температура 20 °C при 765 nm и се конструира калибрационната крива. 0,1 mL от метаноловия растителен екстракт (1 mg/mL) се смесва със същите реагенти, както е описано по-горе, и след 2 часа се измерва абсорбцията за определяне на растителни феноли. Съдържанието на общи фенолни съединения в изследваните растителни метанолови екстракти се изразява в mg GAE на 1 g DW.
Оценката на общите фенолни киселини (TPC) се извършва съгласно метода на Arnov [ 31 ]. Един милилитър от пробата се смесва с 5 mL дестилирана вода, 1 mL 0,5 М НС1, 1 mL реагент на Arnov и 1 mL NaOH. Впоследствие общото киселинно съдържание се изразява като еквивалент на кафеена киселина (CAE) в mg·g -1 DW.
Общото съдържание на флавоноиди (TF) се измерва с помощта на колориметричен анализ с алуминиев хлорид [ 32 ]. Аликвотна част от 1 L от 0,037, 0,074, 0,112, 0,149 и 0,186 mg/mL метанолови разтвори на рутин или метанолови растителни екстракти (1 mg/mL) се добавя към 10-mL мерителна колба, съдържаща 1 mL H2O. След това , Добавят се 0.3 mL 5% NaNO2 и след 5 min се добавят 0.3 mL 10% AlCl3 . На 6-тата минута се добавят 2 mL 1M NaOH и общият обем се довежда до 10 mL с Н20. Разтворът се смесва добре и абсорбцията се измерва спрямо приготвената празна проба при 510 nm. Общите флавоноиди бяха изразени като mg·g -1 еквиваленти на рутин (RE).
Общи танини (ТТ) Танините се определят, както е описано от Price et al. [ 33 ], последвано от малка модификация от Najda [ 34 ]. Проба (1.0 g) се смесва с 10 mL 1% разтвор на метанол/HCl в тъмна бутилка и се разклаща в продължение на 20 минути при стайна температура. След това сместа се филтрира. Танините в супернатантата бяха оценени чрез използване на 1 mL супернатант и 5 mL смес от ванилин/HCl (чрез смесване на равни обеми от 2% ванилин в метанол и 8% метанол/HCl) в епруветка и задържани за 20 минути на стайна температура. Образуваният цвят се определя при 500 nm. Катехин (CTCH) се използва за получаване на стандартната крива. Общото съдържание на танини се изразява в mg·g -1 DW.
DPPH анализ за отстраняване на радикали.
Активността за улавяне на радикалите на растителните екстракти срещу 2,2-дифенил-1-пикрил хидразил (DPPH•) радикал се определя с помощта на метод [ 35 ] с леки модификации. Аликвотни части от екстрактите с различни концентрации (10–100 µg/mL) се приготвят в метанол. Един милилитър от тези концентрации на екстракт се поставя в епруветки и се добавя метанол (3 mL), последван от 1 mM метанолов разтвор на DPPH• (0,5 mL). Приготвя се също и празен разтвор, съдържащ същото количество метанол и DPPH•. След 30 минути инкубиране при стайна температура, абсорбцията се отчита спрямо празната проба при 517 nm. Инхибирането на свободния радикал от DPPH• в проценти (%) се изчислява по следната формула (Уравнение (1)):
където Ab е абсорбцията на празната проба и Aa е абсорбцията на екстракта.
Химически реактиви
Органични разтворители със спектроскопска чистота са получени от Merck (Дармщат, Германия). Всички стевиол гликозиди с чистота ≥ 95% (референтни стандарти), галова киселина (GAE) с чистота ≥ 95% (референтен стандарт), кафеена киселина (CAE) с чистота ≥ 95% (референтен стандарт), рутин (RE) чистота ≥95 % (референтен стандарт), катехин (CTCH) чистота ≥ 95 % (референтен стандарт) и 2,2-дифенил-1-пикрил хидразил е от Sigma–Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Реактивът Folin и Ciocalteu, реактивът Arnov, оцетната киселина, HCl, лутеолинът и 1 N натриев хидроксид са от компанията POCH (Gliwice, Полша).
Молекулярни анализи
Екстракция на ДНК
ДНК се изолира от 10 произволно избрани растения (свежи млади листа) в две репликации. ДНК се екстрахира по метода CTAB (Cetyl Trimethylammonium Bromide), описан от Doyle и Doyle [ 36 ]. Концентрацията на ДНК се определя с помощта на Thermo Scientific NanoDrop спектрофотометър (Wilmington, DE, USA). Тестовите проби се разреждат до крайна концентрация 20 ng/μL.
RAPD анализ
Десет 10-базови праймера, избрани от 40 произволни праймера, бяха използвани за PCR амплификация. ДНК амплификацията за RAPD маркери се извършва в краен обем от 15 μL, съдържащ 0,5 U Taq ДНК полимераза (Fermentas, Вилнюс, Литва), 0,3 μL олигонуклеотиден праймер (10 μM), 200 μM dNTPs, 1X PCR буфер с MgCl 2и 40 ng геномна ДНК като матрици. Амплификацията се извършва в градиентен термичен циклер (Biometra GmbH, Jena, Германия) с реакционни условия, програмирани като първоначално преденатуриране при 94 °C за 4 min, последвано от 44 цикъла на денатуриране при 94 °C за 1 min, отгряване при 36 ° С за 1 минута и удължаване при 72 °С за 2 минути. Последното удължаване се извършва за 7 минути при 72 °C с температура на задържане от 4 °C. PCR продуктите се подлагат на електрофореза в 1,5% агарозни гелове, оцветени с етидиев бромид при постоянно напрежение (3 V/cm гел), докато бромофенол синьо/зареждащо багрило мигрира към другия край на гела. Гелът се визуализира на UV-трансилюминатор и се снима с помощта на GeneSnap ver. 7.09 (SynGene, Frederick, MD, САЩ) система за документиране на гел. GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus беше използван за установяване на молекулното тегло на продуктите.
Химически и ДНК анализ на данни
Използва се ANOVA (Statgraphics Centurion, Warrenton, VA, USA) за изследване на влиянието на генотиповете върху съдържанието на стевиол гликозиди, антиоксиданти, феноли, флавоноиди и танини. В този анализ хомогенните групи показват статистически разлики между генотиповете (α = 99%). Анализът на репликираните стойности, стандартните грешки (±) и най-малко значимата разлика (LSD) бяха използвани за откриване на разлики между средните стойности ( p <0.05) бяха извършени чрез използване на теста на Tukey. Всички данни, включени в анализа, бяха извършени в три екземпляра.
RAPD продуктите (ясно разпознаваеми и повтарящи се) бяха оценени като налични (1) или отсъстващи (0) въз основа на снимките. Приема се, че лентата е мономорфна, ако е открита във всички изследвани индивиди. Тъй като полиморфен профил разглежда ленти, открити в определени генотипове, специфичният е ограничен до конкретен индивид. Разделителната способност на праймера се изчислява по формулата: Разделителна способност (Rp) = ΣIb, където информативността на лентата е Ib = 1 − [2(0,5 − p)], p е съотношението на поява на ленти в генотипите извън общ брой генотипове [ 37 ]. Генетичните сходства по двойки (SI-индекс на сходство) между изследваните генотипове бяха оценени съгласно формулата на Dice след Nei и Li [ 38] .]. Клъстерен анализ беше проведен с помощта на метода на разстоянието UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean) в програмата PAST [ 39 ]. Клъстерният анализ, базиран на концентрацията на стевиол гликозиди (% DW) и полифеноли (mg/g -1 DW), беше извършен с помощта на метода на средно свързване, наличен в STATISTICA 13.1. [ 40 ].